趙喜云　張杰　熊文　王嬌　張映

摘要[目的] 研究鹽堿地產(chǎn)脂肪酶的中度嗜鹽菌菌株的形態(tài)和生理生化特點(diǎn)及其所產(chǎn)胞外脂肪酶的性質(zhì)。 [方法]利用平板篩選法分離得到一株產(chǎn)脂肪酶中度嗜鹽菌，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)、生理生化和分子水平的鑒定，并對(duì)其產(chǎn)生的脂肪酶的部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。[結(jié)果]產(chǎn)脂肪酶的菌株命名為Nesterenkonia halobia sp.ZF03。對(duì)脂肪酶粗酶液酶學(xué)性質(zhì)的研究結(jié)果顯示該脂肪酶的最適反應(yīng)溫度在46～50 ℃之間，溫度小于70 ℃時(shí)的穩(wěn)定性較好；最適pH為8.5，在pH 7.5～9.5范圍內(nèi)，相對(duì)酶活性較高，酶具有良好的穩(wěn)定性；反應(yīng)的最適NaCl濃度為0～3%，在0～5% NaCl濃度下有很好的穩(wěn)定性。[結(jié)論]分離得到了一株產(chǎn)脂肪酶活性較高的中度嗜鹽菌。

關(guān)鍵詞中度嗜鹽菌；脂肪酶；鑒定；酶學(xué)性質(zhì)

中圖分類號(hào)S181.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）04-01138-03

基金項(xiàng)目2013年度大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201310225116）；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助（DL11CA01）；東北林業(yè)大學(xué)國(guó)家基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)基金——科研訓(xùn)練及科研能力提高項(xiàng)目（201218A3）；哈爾濱市青年科技創(chuàng)新人才基金資助項(xiàng)目（RC2009QN015018）；黑龍江省自然科學(xué)基金面上資助項(xiàng)目（E201148）。

作者簡(jiǎn)介趙喜云（1989- ），女，山東聊城人，本科生，專業(yè)：環(huán)境微生物。*通訊作者，副教授，博士，從事環(huán)境微生物研究。

中度嗜鹽菌是一群能在含有0～32%NaCl的環(huán)境中生長(zhǎng)的極端環(huán)境微生物。在所有嗜鹽微生物中，中度嗜鹽菌在自然界中廣泛分布可生長(zhǎng)的鹽度范圍最廣，由于中度嗜鹽菌獨(dú)特的生理性質(zhì)，其功能酶具有較大范圍的鹽耐受性、熱耐受性和對(duì)有機(jī)溶劑的抗性，在酶工業(yè)中，其所生產(chǎn)的酶制劑在特殊條件的生產(chǎn)和研究中可以保持較好的活性，因此，中度嗜鹽菌在工業(yè)生產(chǎn)中有著重要的研究?jī)r(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景[1-2]。

由于工業(yè)生產(chǎn)中某些生產(chǎn)條件的限制，已有的水解酶往往達(dá)不到最大活性，因此尋找能夠適應(yīng)不同溫度、酸堿度以及鹽水活度的極端水解酶就成為一類重要的課題[3-5]。該研究分離得到了一株產(chǎn)脂肪酶活性較高的中度嗜鹽菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化及16S rDNA序列分析鑒定，初步命名為Nesterenkonia halobia sp.ZF03，并對(duì)其不同溫度、pH、鹽度條件下的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，為進(jìn)一步提高酶活性并進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)提供了新思路。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1土樣。試驗(yàn)土樣為大慶采油四廠附近的鹽堿土。

1.1.2培養(yǎng)基。富集培養(yǎng)基：酵母粉6 g/L，酸水解酪蛋白5 g/L，蛋白胨6 g/L，檸檬酸鈉3 g/L，KCl 3 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，F(xiàn)eSO4 0.001 g/L，NaCl 30～120 g/L（不同鹽度梯度），蒸餾水至1 000 ml，pH為7.5～8.0。

脂肪酶發(fā)酵培養(yǎng)基：酸水解酪蛋白5 g/L，酵母粉6 g/L，蛋白胨6 g/L，檸檬酸鈉3 g/L，KCl 3 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，F(xiàn)eSO4 0.001 g/L，NaCl（視需要量），20 ml橄欖油乳化液，蒸餾水至1 000 ml。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基或種子培養(yǎng)基：同富集篩選培養(yǎng)基。

以上培養(yǎng)基固體平板均加入18～20 g/L瓊脂。

1.1.3主要試劑。Taq酶、dNTP、Taq酶buffer、16S rDNA通用引物購(gòu)自大連TaKaRa公司，凝膠回收試劑盒購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1菌種的篩選。參考文獻(xiàn)[6]進(jìn)行產(chǎn)脂肪酶菌種的篩選。

1.2.2菌種鑒定。

1.2.2.1形態(tài)學(xué)鑒定。將分離得到的純菌點(diǎn)種于固體種子培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18 h，記錄單菌落的顏色，包括正反面、邊緣、中央部分顏色，記錄單菌落的形狀，包括菌落及邊緣的形狀，記錄菌落透明度、大小、表面隆起及菌落培養(yǎng)基的顏色等。在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)大小。并做革蘭氏染色、芽孢染色及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)。

1.2.2.2生理生化鑒定。參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行氧化酶、過(guò)氧化氫酶、酯酶、脂肪酶、淀粉酶、酪素降解、明膠水解等生理生化鑒定。

1.2.2.316S rDNA分子鑒定。參考文獻(xiàn)[8-9]進(jìn)行16S rDNA分子鑒定，利用ClustalX 1.83軟件進(jìn)行同源性分析，再用MEGA 4.0軟件中N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3酯酶活力測(cè)定。參照文獻(xiàn)[9]方法制備粗酶液，測(cè)定脂肪酶活力。

2結(jié)果與分析

2.1菌株的篩選獲得了幾株產(chǎn)脂肪酶菌株，其中一株水解圈直徑17.33 mm，菌落直徑4.33 mm，酶活力較高，為7.18 U/ml，命名為ZF03。

2.2菌株的鑒定

2.2.1形態(tài)及生理生化特征。將ZF03菌株于37 ℃條件下倒置培養(yǎng)3 d 后，觀察到的菌落形態(tài)為圓形，表面光滑，不透明，邊緣整齊，菌落白色，中間稍凸起，不粘稠，光滑無(wú)皺紋。菌體染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌體，細(xì)胞呈球狀、多聯(lián)球或成團(tuán)，革蘭氏染色呈陽(yáng)性，無(wú)芽孢、穿刺培養(yǎng)無(wú)擴(kuò)散現(xiàn)象。生理生化特性試驗(yàn)結(jié)果中酯酶、硝酸鹽還原、葡萄糖、甘油、可溶性淀粉、脂肪酶、蔗糖反應(yīng)為陽(yáng)性結(jié)果；氧化酶、過(guò)氧化氫酶、淀粉酶、酪素降解、明膠水解、吲哚反應(yīng)、H2S產(chǎn)生、乳糖、果糖反應(yīng)為陰性結(jié)果。

2.2.216S rDNA分子鑒定。將ZF03菌株的16S rDNA 序列進(jìn)行PCR、電泳回收純化后直接進(jìn)行測(cè)序分析，最終確定所得序列長(zhǎng)度為1 416 bp。

在NCBI中，將所得序列結(jié)果進(jìn)行Blast同源性查找比對(duì)，并用MEGA 4.0軟件中NJ法構(gòu)建ZF03菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果如圖1所示。圖2表明與ZF03菌株的序列同源性達(dá)到97%以上的都是Nesterenkonia屬的菌種，ZF03與Nesterenkonia halobia strain DSM 20541和Nesterenkonia halophila strain YIM 70179的親緣關(guān)系最近，而ZF03與YIM 70179的形態(tài)學(xué)特征理化性質(zhì)基本一致，因此，菌種ZF03可能就是YIM 70179或者是同一祖先進(jìn)化的產(chǎn)物?？梢源_定的是ZF03為耐鹽的涅斯捷連科氏菌（Nesterenkonia halobia）[9-10]，所以暫且命名為Nesterenkonia halobia sp.ZF03。

2.3.1溫度對(duì)ZF03脂肪酶活性的影響。

2.3.1.1ZF-03脂肪酶最適反應(yīng)溫度。在不同溫度條件下保溫15 min利用對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯為反應(yīng)底物，加入粗酶液1 ml，反應(yīng)10 min在410 nm波長(zhǎng)下測(cè)定脂肪酶活性。以相對(duì)酶活性為縱坐標(biāo)來(lái)表示測(cè)定結(jié)果（即活性最高的為100%），以下測(cè)定同此。由圖2可見(jiàn)，在45～55 ℃條件下脂肪酶活性比較高，最適反應(yīng)溫度在46～50 ℃之間，當(dāng)反應(yīng)溫度超過(guò)55 ℃后，隨著溫度的升高，脂肪酶活性在下降。

2.3.2.1ZF03脂肪酶最適反應(yīng)pH。將酶分別加入不同pH的反應(yīng)液中，最適宜反應(yīng)溫度下測(cè)定酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可見(jiàn)，脂肪酶與底物作用的最適pH為8.5，此時(shí)酶活力最大，在pH為7.5～9.5范圍內(nèi)，酶反應(yīng)的活力較高，小于7.5或者大于9.5時(shí)，該酶活性呈明顯降低的趨勢(shì)。

2.3.3.1ZF03脂肪酶最適反應(yīng)NaCl濃度。配制不同鹽度0、3%、5%、10%、15%、20%、25%、30%（W/V）的反應(yīng)液，在最適pH和最適溫度下，加入底物反應(yīng)10 min，然后測(cè)定酶活力。由圖6可見(jiàn)，反應(yīng)的最適NaCl濃度為0～3%，但在0～10%濃度下相對(duì)酶活性也可以達(dá)到80%以上，當(dāng)鹽濃度大約15%時(shí)，酶活力快速減弱，可能高鹽環(huán)境抑制了酶的活性。

3結(jié)論

（1）從大慶采油廠附近鹽堿土中分離篩選出一株高產(chǎn)脂肪酶的中度嗜鹽菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化及16S rDNA序列分圖7NaCl濃度對(duì)脂肪酶穩(wěn)定性的影響析把其命名為Nesterenkonia halobia sp.ZF03。

（2）對(duì)脂肪酶粗酶液酶學(xué)性質(zhì)的研究結(jié)果顯示該脂肪酶的最適反應(yīng)溫度在46～50 ℃之間，溫度小于70 ℃時(shí)的穩(wěn)定性較好；最適pH為9.0，在pH 7.0～9.5范圍內(nèi)，相對(duì)酶活性較高，酶具有良好穩(wěn)定性；反應(yīng)的最適NaCl濃度為0～3%，在0～5% NaCl濃度下有很好的穩(wěn)定性。

（3）該研究摸索出了一種篩選鹽堿土中產(chǎn)脂肪酶中度嗜鹽菌的方法，分離鑒定出了產(chǎn)脂肪酶中度嗜鹽菌的新菌株，并對(duì)其不同溫度、pH、鹽度條件下的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，為進(jìn)一步提高酶活性并進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)提供了新思路。

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