孫百靈 曲柏宏 楊宏霞 鹿艷新 王雪 曹麗

摘要 以蘋果梨果實(shí)為試驗(yàn)材料，克隆得到CHI基因cDNA序列（片段），GenBank登錄號(hào)：JN120854，其長(zhǎng)度為444 bp，推斷其編碼148個(gè)氨基酸序列。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，該氨基酸序列與其他植物CHI氨基酸序列的同源性在90%左右，與砂梨CHI氨基酸序列聚類關(guān)系最近，該CHI基因cDNA序列含有常用的限制性內(nèi)切酶BamHI的識(shí)別位點(diǎn)。半定量RTPCR分析結(jié)果表明，隨著果實(shí)的成熟，套袋果與未套袋果CHI基因的表達(dá)量都不斷增加，但套袋果在果實(shí)成熟期的表達(dá)量明顯高于未套袋果。

關(guān)鍵詞 蘋果梨;果實(shí);花青苷;CHI;表達(dá)分析

中圖分類號(hào) S661.2 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A ?文章編號(hào) 0517-6611（2014）34-12043-03

Molecular Cloning and Expression Analysis of Chalcone Isomerase Gene from Pingguoli Fruit

SUN Bailing1， QU Baihong2，YANG Hongxia2， CAO Li2* et al

（1. Vocational and Technical Education of Weichang ManMeng Nationality Autonomous County， Chengde， Hebei 068451; 2. Agricultural College of Yanbian University， Yanji， Jilin 133002）

Abstract Pingguoli fruit was used as material in the experiment， CHI gene cDNA sequence （fragment） was cloned， accession number： JN120854， partial sequence was 444 basepair， coding 148 amino acids. Bioinformatics analysis results show that CHI amino acid sequence homology is 90% with other plant， and CHI amino acid of the Pingguoli had closer relationship with Shali， there was a commonly used restriction enzyme site for BamHI from CHI gene cDNA sequence. The semiquantitative RTPCR technique showed that as fruit mature， expression of CHI gene is increasing constantly about bagged fruit and not bagged fruit， but bagged fruit of expression obviously higher than not bagged fruit in the fruit mature.

Key words Pingguoli; Fruit; Anthocyanin; CHI; Expression analysis

果實(shí)的顏色主要取決于果實(shí)下表皮細(xì)胞中的葉綠素、類胡蘿卜素、類黃酮以及花青素的含量。這幾種色素在果實(shí)不同發(fā)育階段含量不同，紅色品種從生長(zhǎng)期過(guò)渡到成熟階段，果實(shí)的底色由綠變黃，同時(shí)在底色的基礎(chǔ)上著生紅色或紫紅色。底色的變化是由于葉綠素的分解和類胡蘿卜素含量的增加，而紅色的產(chǎn)生是由于花青苷的合成[1]。

花青苷是植物體內(nèi)的一類次生代謝物質(zhì)，是苯丙氨酸代謝的產(chǎn)物，目前對(duì)花青苷形成機(jī)制和影響因素已有詳細(xì)的報(bào)道[2-3]，甚至有人對(duì)花青苷生物合成的遺傳和發(fā)育調(diào)控也進(jìn)行了研究[4-5]?；ㄇ嘬赵诙喾N酶的催化作用下合成，其中查爾酮異構(gòu)酶（CHI）在花青苷合成途徑中非常重要，在CHI缺乏的玉米突變體中，會(huì)出現(xiàn)查爾酮積累而使子粒呈古銅色。因此，筆者對(duì)蘋果梨果實(shí)CHI基因的cDNA克隆及表達(dá)分析進(jìn)行研究，從分子生物學(xué)角度探討蘋果梨果實(shí)著色的生理機(jī)制，為進(jìn)一步探明梨果實(shí)著色的分子機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料。

采用延邊華龍集團(tuán)果樹(shù)場(chǎng)綠色蘋果梨示范基地的蘋果梨果實(shí)，取樣后，果皮用錫箔紙包好，液氮速凍后，保存在-80 ℃冰箱中備用。

1.1.2 菌株和載體。

大腸桿菌DH5α為延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存。pMD18T載體購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司（Takara）。

1.1.3 酶和生化試劑。

EX Taq酶、普通Taq酶、反轉(zhuǎn)錄酶（MMLV）、dNTPs、凝膠回收試劑盒等均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司（Takara），引物由北京英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 套袋處理及取樣時(shí)期。

套袋種類選擇單面蠟質(zhì)的洛川雙層紙袋。套袋時(shí)期為盛花后4～5周。在采前18 d進(jìn)行解袋處理（雙層袋，先除去外層紙袋，3～5 d后除去內(nèi)層袋）。分別在果實(shí)膨大期、著色期（前期、中期、后期）、成熟期取樣，未套袋的作為對(duì)照（CK）。

1.2.2 蘋果梨果皮總RNA的提取及cDNA合成。

采用改良的CTAB法提取果皮總RNA，該方法分別參考Zeng等[6]、王西成等[7]、Bekesiova等[8]和Porebski等[9]的核酸提取方法改進(jìn)而成。將RNA溶于30 μl的DEPCH2O中，在1.2%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)總RNA的完整性，電壓為5 V/cm，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA的A260、A280，其余置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

用寶生物工程（大連）有限公司（Takara）MMLV（RNase H-）反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈，以O(shè)ligo（dT）18為反轉(zhuǎn)錄引物，起始RNA為3 μl 總RNA。

1.2.3 蘋果梨果實(shí)CHI基因的RTPCR擴(kuò)增。

對(duì)NCBI上已登錄的西洋梨和砂梨栽培品種的CHI核苷酸進(jìn)行多序列比對(duì)，利用Oligo 6軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，對(duì)蘋果梨果實(shí)CHI基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，引物序列：

上游引物5′ATGGCTCCACCACCATCGCTCGCT3′;

下游引物5′CGGTGGGAAGTTTTGATCTTTGAA3′。

PCR反應(yīng)體系：25 μl 總反應(yīng)體積中含模板第一鏈 cDNA 1 μl，上下游引物各1 μl（20 μmol/L），dNTP Mixture 1.5 μl（2.5 mmol/L），MgCl21.5 ?μl （25 mmol/L），Ex Taq DNA 聚合酶0.2 μl（5 U/μl），10×Buffer 2.5 μl，其余用重蒸餾水補(bǔ)充。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s，59 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠電泳觀察特異擴(kuò)增片段。

1.2.4 PCR產(chǎn)物純化回收及測(cè)序。

參照TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化回收，于克隆載體pMD18T連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選及PCR鑒定陽(yáng)性克隆后，送北京英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.5 生物信息學(xué)分析。

同源性分析：借助DNA Star軟件，對(duì)所得序列與Genbank上有關(guān)序列進(jìn)行同源性分析，挑選典型物種序列進(jìn)行多序列比對(duì)，Gene doc生成比對(duì)結(jié)果，并利用該軟件對(duì)比對(duì)結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

利用DNA Star軟件確定CHI基因序列的酶切位點(diǎn)。

1.2.6 蘋果梨CHI基因的半定量RTPCR分析。

18SrRNA進(jìn)行RTPCR可以被擴(kuò)增出來(lái)，且經(jīng)常用作內(nèi)參基因[10]，反轉(zhuǎn)錄后根據(jù)18SrRNA基因的表達(dá)量確定不同處理cDNA模板的相對(duì)含量，根據(jù)18SrRNA基因的擴(kuò)增量，調(diào)整各處理樣品的cDNA模板的絕對(duì)含量一致。對(duì)西洋梨和砂梨栽培品種的18SrRNA核苷酸進(jìn)行多序列比對(duì)，設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，引物序列為：

上游引物5′GACTGTGAAACTGCGAATGGCTCA3′;

下游引物5′ACTATCCTACCATCGAAAGTTGAT3′。

PCR反應(yīng)體系同CHI基因的RTPCR擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s，54.8 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠電泳觀察特異擴(kuò)增片段。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果梨果皮總RNA完整性檢測(cè)

從圖1可以看出，改良的CTAB法提取的蘋果梨總RNA出現(xiàn)明顯的28 s、18 s、5 s 3條帶，帶型規(guī)則整齊，且28 s的條帶亮度是18 s的2倍，說(shuō)明所提取RNA基本沒(méi)有降解，結(jié)構(gòu)較為完整。

2.2 蘋果梨果皮總RNA的提取純度

通過(guò)A260與A280的比值可以判斷RNA的純度，高質(zhì)量RNA的A260/A280應(yīng)在1.8～2.0。改良的CTAB法提取RNA的A260/A280均介于1.8～2.0（表1），說(shuō)明所提取的總RNA純度較高，濃度也較高，無(wú)蛋白質(zhì)、DNA、多糖等物質(zhì)的殘留。

2.3 蘋果梨CHI基因cDNA片段的克隆

由圖2可知，將提取的蘋果梨果皮總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板

注：1.果實(shí)膨大期;2.果實(shí)著色前期;3.果實(shí)著色中期;4.果實(shí)著色后期;5.果實(shí)成熟期。

圖1 不同時(shí)期取樣的套袋蘋果梨果皮總RNA電泳圖譜

表1 改良CTAB法提取總RNA紫外分光光度計(jì)分析結(jié)果

取樣時(shí)期A260A280A260/A280

果實(shí)膨大期0.0780.0411.897 6

果實(shí)著色前期0.0670.0351.932 4

果實(shí)著色中期0.0620.0321.961 8

果實(shí)著色后期0.0820.0431.909 8

果實(shí)成熟期0.0590.0311.871 4

進(jìn)行RTPCR反應(yīng)，用1.2%的瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，發(fā)

現(xiàn)擴(kuò)增出一條444 bp的片段，與預(yù)測(cè)目的片段的大小一致。

圖2 蘋果梨CHI基因的RTPCR擴(kuò)增

2.4 蘋果梨CHI基因多序列比對(duì)及其系統(tǒng)發(fā)育分析

蘋果梨CHI基因片段cDNA序列經(jīng)Blast比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與大多數(shù)已登錄的其他植物的CHI基因序列同源性在90%左右，其中與西洋梨有95%的相似度，說(shuō)明已成功克隆出蘋果梨CHI基因片段。將該片段cDNA對(duì)應(yīng)的氨基酸序列在NCBI上運(yùn)行blastp，比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，它與多種植物的CHI氨基酸序列具有較高的同源性，特別是與砂梨、西洋梨的同源性分別達(dá)到95%、93%。

圖3 蘋果梨和其他植物的CHI氨基酸序列比對(duì)結(jié)果

利用DNA Star軟件，對(duì)蘋果梨CHI氨基酸序列及從GeneBank中獲取的其他植物CHI氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。從圖4可以看出，蘋果梨與砂梨CHI氨基酸序列聚類關(guān)系最近，預(yù)示植物CHI基因在進(jìn)化過(guò)程中維系著較為保守的結(jié)構(gòu)和功能。

2.5 CHI基因cDNA序列酶切位點(diǎn)

利用DNA Star軟件確定CHI基因cDNA序列的酶切位點(diǎn)，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5

可知，所克隆的CHI基因cDNA序列富含多酶切位點(diǎn)，其中

含有常用的限制性內(nèi)切酶BamHI的識(shí)別位點(diǎn)。

圖4 蘋果梨與砂梨、西洋梨、蘋果、桃、甜櫻桃CHI基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

圖5 蘋果梨果實(shí)CHI基因序列的酶切位點(diǎn)

2.6 蘋果梨CHI基因的半定量RTPCR分析

應(yīng)用半定量RTPCR研究了CHI在不同取樣時(shí)期的蘋果梨果皮中的表達(dá)，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，套袋果與未套袋果CHI基因在果實(shí)膨大期、著色期（前期、中期、后期）、成熟期均能檢測(cè)到，隨著果實(shí)的成熟，CHI基因的表達(dá)量不斷增加，但套袋果在果實(shí)成熟期的表達(dá)量明顯高于未套袋果。

注：1.果實(shí)膨大期;2.果實(shí)著色前期;3.果實(shí)著色中期;4.果實(shí)著色后期;5.果實(shí)成熟期。

圖6 不同取樣時(shí)期套袋與未套袋果實(shí)CHI基因的表達(dá)

3 討論

查爾酮異構(gòu)酶是花青苷合成途徑中至關(guān)重要的酶，其作用主要是催化查爾酮環(huán)的閉合，因此，該基因的克隆對(duì)于花青苷合成的研究非常重要。該研究首次從蘋果梨果皮中克隆了CHI基因（片段），并通過(guò)半定量RTPCR技術(shù)對(duì)該基因的表達(dá)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，套袋果在果實(shí)成熟期的表達(dá)量明顯高于未套袋果，這也是利用套袋技術(shù)來(lái)促進(jìn)果實(shí)著色的原因，同時(shí)，也說(shuō)明CHI基因是形成蘋果梨紅色果皮的關(guān)鍵基因之一。

通過(guò)在Genebank上檢索與蘋果梨近緣物種的CHI基因序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蘋果梨CHI基因序列與西洋梨有95%的相似度，說(shuō)明基因克隆成功。進(jìn)一步對(duì)CHI基因進(jìn)行多物種間親緣進(jìn)化關(guān)系的比較發(fā)現(xiàn)，CHI基因在不同科植物間有較大的差異性，而在同一科CHI基因的保守性很高，因此可以利用CHI基因保守性強(qiáng)的原理進(jìn)行同一科屬間基因的克隆，對(duì)于提高基因克隆的成功率具有重要意義。

42卷34期

孫百靈等 蘋果梨果實(shí)CHI基因cDNA克隆及表達(dá)分析

參考文獻(xiàn)

[1] 呂忠恕.果樹(shù)生理[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1983：341-342.

[2] REAY P E，F(xiàn)LETCHER R H，THOMAS V J，et al.Chlorophylls，carotenoids and anthocyanin concentrations in the skin of `Gala' apples during maturation and the influence of foliar applications of nitrogen and magnesiu m[J].J Sci Food Agric，1998，76：63-71.

[3] LI Z，GEMMA H，IWAHORI S.Stimulation of ‘Fuji apple skin color by ethephon and phosphorus calcium mixed compounds in relation to flavonoid synthesis[J].Scientia Horticulturae，2002，94（7）：193-199.

[4] HONDA C，KOTODA N，WADA M，et al.Anthocyanin biosynthetic genes are coordinately expressed during red coloration in apple skin[J].National Institute of Fruit Tree Science，2002，40（8）：955-962.

[5] BAN Y，HONDA C，HATSUYAMA Y，et al.Graduate School of Life and Environmental Sciences [J].Plant Cell Physiol，2007，48（7）：58-70.

[6] ZENG Y，YANG T.RNA isolation from highly viscous samples rich in polyphenols and polycacharides[J].Plant Molecular Bology Reporter，2002，20：417.

[7] 王西成，喬玉山，歐春青，等.三種梨果皮總RNA提取方法的比較研究[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010（2）：91-94.

[8] BEKESIOVA I，NAP J P，MLYNAROVAL L，et a1.Isolation high quality DNA and RNA from leaves of the Carnivorous plant Drosera rotundifolia[J].Plant Molecular Biology Reporter，1999，17：269-277.

[9] POREBSKI S，BAILEY L G，BAUM B R，et a1.Modification of a CTAB DNA extraction protocol for Plants containing high polysaccharide and polyphenol components[J].Plant Molecular Biology Reporter，1997，15（1）：8-15.

[10] 宗成文.葡萄花發(fā)育相關(guān)基因的克隆與表達(dá)特性研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.