陳佩佩　程賀　趙長新

摘要：本文建立了梨孢鐮刀菌的PCR檢測方法，并對PCR體系中反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化：引物檢測梨孢鐮刀菌的最適退火溫度為52℃；Taq DNA酶的最適用量為0.4μl；最適Mg2+離子濃度為2.0mM；最適循環(huán)數(shù)為30次循環(huán)；；微管蛋白基因引物具有良好的特異性；梨孢梨孢鐮刀菌DNA的最低檢測限為417pg，表現(xiàn)出良好的靈敏性。

關(guān)鍵詞：梨孢鐮刀菌 PCR 條件優(yōu)化

中圖分類號：Q36 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1672-5336（2014）06-0028-02

1 引言

本文建立了梨孢鐮刀菌的PCR檢測方法，在制麥早期內(nèi)檢出大麥內(nèi)部的梨孢鐮刀菌，及早地防止毒素對原料的污染以及有效地控制啤酒噴涌，對大麥品質(zhì)的判斷提供了簡單易行，快速的手段，從而為提高麥芽品質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

2.1.1 菌種

梨孢鐮刀菌Fusarium poae（AY188915.1）來自本實驗室從澳大利亞大麥（Hordeum sp.Schooner）中分離鑒定的菌株；禾谷鐮刀菌是本實驗保存；大腸桿菌（CGMCC-1.1369）、乳酸克魯維酵母（CGMCC-2.1494）購自中國微生物菌種保藏中心；乳酸桿菌來自北京三元食品有限公司技術(shù)中心實驗室。

2.1.2 主要試劑

溶菌酶、RNaseA、EDTA、SDS、NaCl、無水乙醇、等均為國產(chǎn)分析純；瓊脂糖（Spain Agarose香港基因公司分裝）；Taq DNA 聚合酶、dNTPs、100bp DNA Marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，PDA培養(yǎng)基，PBS溶液。

2.1.3 儀器

ZPS-250 h智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱，Unic-7200紫外分光光度計，低速離心機LD4-2A（2800×g），高速冷凍離心機B22 m，2100P型自動糖化器，精密電子稱，電熱鼓風(fēng)干燥箱，HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，GeneAmp PCR System 2400 PCR，PAC300電泳儀，Tanon GIS 2010凝膠成像儀，離心機2K15（Sigma），Thermo pH計，LRH-250生化培養(yǎng)箱，Cintra 20分光光度計。

2.2 實驗方法

2.2.1 模板DNA的提取

在無菌條件下，用滅菌處理的接種環(huán)挑取梨孢鐮刀菌菌落，接種于5ml PDA培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)3天后使用無菌濾紙進(jìn)行過濾獲得菌絲體。稱取約0.1g菌絲體提取基因組DNA，提取方法參考文獻(xiàn)。

2.2.2 擴增引物的設(shè)計

依據(jù)引物設(shè)計原則，利用生物軟件ClustalW比對及Primer 5.0設(shè)計引物，引物由北京博邁德科技發(fā)展有限公司合成。引物的基因位點為46-337，PCR擴增產(chǎn)物長度分別為292bp。

2.2.3 PCR反應(yīng)

梨孢鐮刀菌基因組DNA的PCR擴增，反應(yīng)體系為：模板1μl，上游引物0.5μl（25μmol/l），下游引物0.5μl（25μmol/l），10×擴增反應(yīng)緩沖液2μl，PCR染料2μl，dNTPs 0.5μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，無菌超純水13μl，總體積為20μl。

離心混勻后置PCR儀上進(jìn)行自動化擴增反應(yīng)，循環(huán)參數(shù)為94℃預(yù)變性5min，94℃變性45s，52℃退火30s，72℃延伸1min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。

2.2.4 PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

（1）退火溫度的優(yōu)化。設(shè)置退火溫度的梯度為49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃，在這幾個退火溫度中優(yōu)化出最適退火溫度。（2） Taq DNA酶濃度的優(yōu)化。Taq DNA酶的濃度梯度為1.0U、1.5U、2.0U、2.5U，相對應(yīng)的體積為0.2μl、0.3μl、0.4μl、0.5μl，在這幾個酶濃度中優(yōu)化出最適酶濃度。（3）Mg2+離子濃度的優(yōu)化。Mg2+離子濃度的梯度為：1.0mM、1.5mM、2.0mM、2.5mM，已知Mg2+離子濃度為25mM，所需要的體積分別為：0.8μl、1.2μl、1.6μl、2.0μl，在這幾個濃度中優(yōu)化出最適Mg2+離子濃度。（4）循環(huán)數(shù)優(yōu)化。設(shè)置循環(huán)數(shù)為28、30、32，從中優(yōu)化出最適循環(huán)數(shù)。

3 結(jié)果與討論

3.1 梨孢鐮刀菌的存在位置以及生長活動

觀察圖1（a）中的大麥表面的光學(xué)顯微鏡圖，可以發(fā)現(xiàn)鐮孢菌菌絲可以透過大麥種皮生長；圖1（b）是麥芽染菌圖片，A所指是鐮刀菌存在于大麥腹溝位置，B所指為菌絲由麥芽根部伸出，C所指為鐮刀菌包圍種子。

3.2 PCR反應(yīng)結(jié)果

3.2.1 PCR反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

（1）最適退火溫度的選擇。退火溫度為49℃～54℃時都有特異性的目的帶擴出，且無非特異性條帶。比較可知退火溫度為52℃時292bp目的帶較寬較清晰，故選52℃為該引物檢測梨孢鐮刀菌的最適退火溫度。（2）最適Taq DNA酶濃度的選擇。體積為0.4μl即濃度為2.0U時，目的帶較亮較清晰，故0.4μl為Taq DNA酶的最適用量。（3）Mg2+離子濃度的選擇。最適Mg2+離子濃度為2.0mM。（4）循環(huán)數(shù)的選擇。循環(huán)數(shù)為30時，PCR擴增效果最佳，故選擇30次循環(huán)為最適循環(huán)數(shù)。

3.2.2 引物的特異性分析

使用微管蛋白基因的引物同時對大腸桿菌、乳酸桿菌、乳酸克魯維酵母、禾谷鐮刀菌、梨孢鐮刀菌以及陰性對照進(jìn)行PCR檢測，陰性對照和對照組均無條帶擴出，可知，該引物具有良好的特異性。

3.2.3 DNA的最低檢出限的確定

使用紫外分光光度計測定260nm波長下的OD值為0.8336，DNA含量=417μg/ml，將其逐步進(jìn)行10倍系列稀釋，將這些DNA稀釋液作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，梨孢鐮刀菌DNA的最低檢測限為417pg。

4 結(jié)語

本研究結(jié)果表明，使用PCR手段檢測梨孢鐮刀菌的方法是可行的，且檢測的周期短，具有很高的靈敏度，避免在后續(xù)的啤酒發(fā)酵工序中由梨孢鐮刀菌產(chǎn)生的毒素造成原料的污染和浪費，在制備麥芽時起到了預(yù)防的作用。

參考文獻(xiàn)

[1]俞大鈸.鐮刀菌分類學(xué)的意義.微生物學(xué)報，1977，17（2）：163-171.