張風林 張振安 張靜

【摘 要】目的：研究Survivin基因沉默對人肺腺癌A549細胞增殖和對化療藥物吉非替尼敏感性的影響。方法：設計合成survivin的siRNA序列，LipofectamineTM2000 轉染入A549細胞。采用RT-PCR和Western blot檢測survivin在干擾后mRNA和蛋白的表達情況，利用流式細胞儀檢測細胞周期。通過MTT法和細胞克隆形成試驗法察survivin基因沉默后A549細胞對吉非替尼的敏感性。結果：Survivin基因沉默48h后，A549細胞的survivin基因和蛋白表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。細胞周期被阻滯在G0/G1期，S期細胞數(shù)減少；差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。survivin基因沉默組細胞對吉非替尼的敏感性顯著性增強。結論：特異性siRNA介導的Survivin使細胞A549增殖減少，增強其對易瑞沙的敏感性。

【關鍵詞】Survivin；siRNA；肺腺癌；A549細胞；細胞增殖；吉非替尼

【中圖分類號】R394 【文獻標識碼】A 【文章編號】1004-7484（2014）03-01113-02

肺癌位居我國惡性腫瘤死亡原因的首位，占全部惡性腫瘤死亡原因的22.7%。我國目前肺癌發(fā)病率每年增長26.9%，預計到2025年，我國的肺癌患者將達100萬，成為世界第一肺癌大國[1]。肺癌對人們健康造成很大危害，本文通過將合成的siRNA轉染入肺腺癌A549細胞，分析siRNA對其Survivin基因沉默的效率；Survivin基因被沉默后對腫瘤細胞周期及其對吉非替的敏感性的影響。為RNA干擾Survivin基因治療肺癌或做為增敏藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1主要材料

肺腺癌細胞株A549購于中國科學院上海細胞究所。MI 1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶和胎牛血清均購自美國Gibco公司。LipofectamineTM2000脂質體轉染試劑和TRIzol購自美國Invitrogen公司；RT-PCR兩步法試劑盒(北京賽百盛基因技術有限公司)， cDNA合成試劑盒(日本TOYOBO公司)；AMV逆轉錄試劑盒(杭州博日)； siRNA基因片段由上海生工生物工程公司合成；G418購自美國Klontech公司；Survivin鼠抗人單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；5%四甲基偶氮唑藍、HRP標記的羊抗鼠二抗購自北京中杉公司；吉非替尼（AstraZeneca UK Limited）；流式細胞儀（COULTER XL; Coulter）；550酶標儀（美國Biorad公司），生物倒置顯微鏡（Olympus CKX4）。ECL試劑盒購自美國Thermo公司；RIPA蛋白裂解液購自江蘇碧云天公司。

1.2siRNA設計、合成及轉染

根據(jù)Genebank中 Survivin cDNA (Acc.No.U75285)的序列 ,通過相應計算機軟件設計靶向 survivin mRNA 45- 65序列，由21個堿基組成的核苷酸鏈,其序列為: 5-GG ACCACCGCAUCUCUACADTDT- 3 ,同時合成互補鏈 ,經(jīng)退火形成雙鏈 ( dsRNA) ,即特異性 的siRNA分子，經(jīng)BLAST查詢 ,確定為 survivin特性序列 ,排除與其他基因的同源性。陰性對照 siRNA的序列為:5- CGUACGCGGAAUACUUCG ADTDT-3 ,此序列不與人類任何基因序列同源。以上核苷酸分子均由上海生工生物工程公司合成。肺腺癌細胞株A549 培養(yǎng)在含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置飽和濕度5％CO2，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2天傳代1次，實驗時取對數(shù)生長期的細胞。按1 × 10 5個／孔將肺A549細胞接種于24孔板中，至融合率達70％時以脂質體法進行轉染。按基因轉染試劑盒說明書進行轉染，轉染時分為3組：轉染pGenesil-1-survivin-siRNA載體者為A549／survivin-siRNA組(實驗組)，轉染隨機對照載體者為A549／control組（對照組），未轉染的肺腺癌細胞株A549細胞為A549組（空白組）。于轉染后48h行 RNA 干擾效應的檢測。

1.3 RT-PCR檢測

細胞棄培養(yǎng)液后PBS沖洗3次，通過TRIzol法提取總RNA，用cDNA合成試劑盒反轉錄合成cDNA。分別擴增Survivin和內(nèi)參GAPDH。Survivin引物序列:正義：5＇-CACCGCATCTCTACATTCAA-3＇，反義：5＇-CTCTTTCTTCGCAGTTTCCA-3＇，擴增產(chǎn)物為345bp。GAPDH 正義：5＇-GTGTCAACGGATTTGGTCGA-3＇， 反義：5＇-GACAAGSTTCCCGTTCT CAG-3＇，擴增產(chǎn)物為180 bp。PCR反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物采用2%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，使用凝膠圖像分析系統(tǒng)進行吸光度掃描并用Survivin吸光度/GAPDH吸光度值作為mRNA表達的相對強度。

1.4 Westem blot檢測

細胞棄培養(yǎng)液后PBS沖洗3次，加入預冷的RIPA裂解液150 μL，RIPA裂解液預先加PMSF1.5 μL使其終濃度為1 mmol/L。操作在冰上進行， 4 ℃下，10 000 r／min離心5 min后取上清液，通過BCA法測蛋白濃度后，99 ℃ 變性10 min。取50 μg蛋白行10%SDSPAGE電泳，通過電轉移印跡到PVDF膜上，封閉液中孵育1 h. 加入1∶1000稀釋的survivin一抗，4℃過夜. TBST洗膜5 min, 共3次. 加入1∶5000 HRP標記的二抗和GAPDH, 于37℃孵育2 h. PBS洗滌，采用ECL法檢測。

1.5 流式細胞儀檢測細胞周期

收集三組細胞，調(diào)整細胞濃度為1×106/L，冷PBS 洗滌2 次, 加入70 %的冷乙醇(4 ℃) 固定24 h后，洗滌細胞，與含10 μg/ ml RNA 酶的Tris-HCL緩沖液(pH7. 4) 共同孵育30 min。50μg/ ml 碘化丙啶( PI)進行細胞的DNA 染色，1 h 內(nèi)通過流式細胞儀分析細胞的DNA含量分布，并計算出各個周期細胞所占的百分率。

1.6 MTT檢測干擾Survivin后A549對吉非替尼的敏感性

細胞轉染干擾質粒48 h后，收集轉染和未轉染的A549細胞， 接種于96孔板 ， 每個樣本做3個復孔， 當細胞貼壁后，加 入不 同濃度的吉非替尼 (2.5、5、10 、20 μmol/ L )培養(yǎng)48 h ；每孔加MT T 20μl (濃度為5mg/ml)，放置孵箱內(nèi)4h后棄上清加入10%的SDS（十二烷基磺酸鈉）200μl，過夜。震蕩15min，用全自動酶標儀（檢測490nm處的吸光度值（A值）。抑制率（%）=（A對照-A實驗）/（A對照-A空白）×100%。

1.7平板克隆檢測干擾Survivin后A549對吉非替尼的敏感性

細胞轉染干擾質粒48 h后，收集轉染和未轉染的A549細胞， 接種于6孔板 ， 每個樣本做3個復孔， 細胞貼壁后，加入不 同濃度的吉非替尼 (2.5、5、10 、20 μmol/ L )培養(yǎng)中培養(yǎng)7天，去除培養(yǎng)液，PBS洗2次，95%乙醇固定10 min，吉姆薩染液染色10 min，自來水沖洗后，晾干，通過Quantity One軟件計算克隆數(shù)?？寺⌒纬梢种坡剩?）=1-（實驗組克隆數(shù)/對照組克隆數(shù)）×100%。

1.8 統(tǒng)計學處理

本研究采用SPSS14.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（ ±s）表示，兩組間連續(xù)變量比較用t檢驗，多組間連續(xù)變量比較用方差分析，協(xié)方差校正，雙側檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 siRNA抑制Survivin mRNA的表達

Survivin mRNA表達的RT-PCR檢測與A549／control組（對照組）和A549組（空白組）比較，A549／Survivin-siRNA組（實驗組）條帶明顯變窄，實驗組與對照組和空白組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1

Fig.1 Detection of Survivin mRNA expression in A549 cells by RT-PCR

2.2siRNA抑制Survivin蛋白的表達

Survivin蛋白表達的Western blot檢測與A549／control組（對照組）和A549組（空白組）比較，A549／Survivin-siRNA組（實驗組）條帶明顯變窄， 其灰度值比較差異有 統(tǒng)計學意義 (P<0.05)。見圖2。

2.3流式細胞儀檢測細胞周期

流式細胞儀分析各組A549細胞的細胞周期，結果顯示，在G0/G1期實驗組較對照組和空白組略有增加，S期略有減少。實驗組與對照組、空白組之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，M期細胞無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。說明有明顯的S期阻滯(表1)。

2.4 干擾Survivin后A549對吉非替尼的敏感性提高

MTT法檢測結果顯示， 在轉染pgsiRNA—Survivin后，A549細胞對不同濃度的吉非替尼敏感性均提高 。隨著藥物濃度的增加，吉非替尼對細胞的抑制率也增加，呈現(xiàn)出劑量依賴性，實驗組細胞對不同濃度的吉非替尼敏感性顯著高對照組和空白組 (均P<0.05 ) ( 表 2 )。

2.5對A549細胞集落形成的影響

平板克隆檢測顯示， 轉染 pgsiRNA—Survivin后，A549細胞對不同濃度的吉非替尼敏感性均提高，細胞克隆形成數(shù)明顯減少，克隆形成抑制率明顯增高(P<0.05 )。隨著藥物濃度的增加，吉非替尼對細胞的克隆形成抑制率也增加，呈現(xiàn)出劑量依賴性，實驗組細胞對不同濃度的吉非替尼克隆形成抑制率顯著高于對照組和空白組 (均P<0.05 ) ( 表 3 )。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是由多種因素共同作用造成的，其中細胞凋亡在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉移過程中起著重要的作用。凋亡抑制蛋白家族(Inhibitor of apoptosis proteins ，IAPs)在抑制細胞凋亡的過程中起到重要作用[2-3]。Survivin是近年發(fā)現(xiàn)的IAPs家族的成員之一，它具有獨特結構的，幾乎表達在所有腫瘤細胞中,而在除胸腺外的正常成人組織中不表達,它與腫瘤的凋亡、增殖及耐藥性的產(chǎn)生有著密切的關系,是腫瘤基因治療的新靶點[4-6]。Survivin在惡性腫瘤中具有較高的表達水平，和腫瘤的淋巴節(jié)轉移、臨床病理分期等都有密切的關系。研究[7]顯示survivin是caspase3和caspase7的直接抑制因子，主要通過抑制Caspase3、Caspase7的活性，來阻斷細胞的凋亡過程，使Caspase3不能降解微管結構蛋白，維持了紡綞體的完整性，可以確保胚胎細胞有絲分裂的順利進行，而在腫瘤組織中survivin過度表達，使腫瘤細胞不斷分裂，惡性增殖永生化，使腫瘤持續(xù)生長。因此針對Survivin干預腫瘤生長有著很大的潛力，有研究[8-9]報道干擾survivin基因后，對結腸癌有著較好的效果。對鼻咽癌也有類似報道[10]。

吉非替尼是E G F R酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，EGFR—TKI)。當EGFR與其配體 ( EGF，TGF-a ) 結合后被激活。介導著一系列的細胞生長信號，繼而促進腫瘤形成和侵襲性生長，EGFR表達增高提示腫瘤預后不良.吉非替尼是臨床應用較早 EGFR—TKI，可特異性作用于腫瘤細胞，而對機體正常組織無毒或低毒，因而是理想的藥物。廣泛的應用于上皮性腫瘤的治療及增敏中。有關吉非替尼治療肺癌的臨床研究[11-12]提示，其在特定的人群如女性、不吸煙、腺癌患者中，吉非替尼能提高無進展生存期，提高生活質量和生存率。但是對于腫瘤的治療需要多途徑多通路的同時綜合治療才會顯現(xiàn)較好的效果，對survivin基因抑制的靶向治療與其它途徑結合的治療是研究的熱點。有資料[13-14]顯示，通過siRNA干擾誘導切除修復交叉互補基因(ERCC1)使survivin表達下調(diào)可以增加肺癌等腫瘤細胞對鉑類藥物的敏感性。Nakamura[15]等將野生型Survivin及其顯性失活突變體分別轉染入胃癌細胞發(fā)現(xiàn)，Survivin過表達可以使胃腺癌MKN45細胞逃避順鉑誘導的凋亡，而Survivin顯性失活突變體的表達則增強順鉑對胃癌細胞株NUGC3細胞的凋亡誘導作用。各種方式對的survivin基因的干擾均對化療藥物治療起到了較好的輔助作用[16]。

我們通過小分子Survivin干擾RNA利用流式細胞儀檢測細胞周期,并MTT法觀察吉非替尼對沉默Survivin后A549細胞的細胞的敏感性，結果發(fā)現(xiàn)Survivin基因被沉默后，細胞周期被阻滯在G0/G1期，S期細胞數(shù)減少，腫瘤生長停滯；吉非替尼對沉默Survivin后A549細胞的細胞的敏感性明顯增加。說明沉默Survivin即可以直接有效降低細胞分裂增殖，也可以增加肺癌細胞對化療藥物的敏感性。本實驗結果提示小分子Survivin干擾RNA沉默Survivin基因能夠增加肺癌細胞對化療藥物的敏感性，可以成為治療或輔助治療肺癌的一個新方向。

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