孫云霄 張禮標 王華倩 張宇 熊祺琰 曹榮月 吳潔

摘 要：利用BSP65 （heat shock protein 65，HSP65）中與炎癥性自身免疫性疾病相關的兩段功能表位EE14（176-189）、DL18 （215-232），通過戊二醛偶聯(lián)法與BSA （bovine serum albumin， BSA）制備成多肽-BSA偶聯(lián)蛋白，獲得可用于免疫高脂膳食動物的蛋白。與PBS （phospllate buffer saline，PBS）組比較，多肽免疫組抗HSP65抗體滴度與總膽固醇（total cholesterol，TC）含量無明顯區(qū)別（P<0.05），抗自身肽的抗體在兩免疫組的結果不同，但兩組主動脈粥樣硬化斑塊的面積都顯著增加，兩免疫組斑塊面積與血管總面積百分比分別為39.61%與36.75%，為PBS組（斑塊面積占血管總面積百分比為10.35 %）的3.8倍和3.6倍，有顯著性差異（P<0.05） 實驗結果表明HSP65相關B細胞表位肽，皮下免疫能顯著促進AS （atherosclerosis，AS）斑塊生成。 在后續(xù)研究中可利用以上表位，通過改變免疫方式，設計可用于抑制AS斑塊生成的免疫調(diào)節(jié)劑，進一步考察HSP65功能性B細胞表位的免疫預防及治療效果。

關鍵詞：動脈粥樣硬化（AS）：熱休克蛋白（HSP）：免疫

中圖分類號：Q789

文獻標識碼：A

文章編號：1007-7847（2014）06-0471-06

近年來國內(nèi)外的研究表明，動脈粥樣硬化（atherosclerosis. AS）是慢性自身免疫性炎癥疾病，適應性免疫和天然免疫反應引起的炎癥反應在AS發(fā)展的所有階段中起著關鍵作用。熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）在進化上被認為是一類高度保守的蛋白，在AS發(fā)病過程中作為自身抗原起著重要的作用。人源的HSP60 （hHSP60）與結核分支桿菌來源的HSP65 （mHSP65）大概存在50%的同源性，高度同源，而原核微生物之間HSP同源性更是能達到97%，兩者具有相似的抗原表位，因此mHSP65能通過分子模擬產(chǎn)生抗人自身HSP60的免疫反應.誘導自身反應性T細胞攻擊自身抗原，引起人自身免疫性反應而促進AS的發(fā)生。

抗原分子在免疫反應過程中起主要作用的是T和B細胞表位。HSP65中有許多與AS相關的表位如36 -45、91-100、111 -120、160 -177、179 -190、215-232、433-450和507-516等，大部分是B細胞表位。通過對AS患者血清內(nèi)獲得抗體和健康人體內(nèi)獲得的抗體對mHSP65與hHSP60進行抗原掃描，結果發(fā)現(xiàn)許多抗原表位是hHSP60與mHSP65共有表位。其中HSP65（179-190）與HSP6525（215-232）就同為HSP65/60兩者共有表位。HSP65（179-190）為佐劑性關節(jié)炎疾病相關重要表位，因為AS與佐劑型關節(jié)炎同為炎癥性自身免疫疾病，研究選擇了與 HSP65（179-190）基本相同的HSP65（176-189） （EESNT-FGLQLELTE）（EE14）B細胞表位來進行致AS研究：而HSP65（215-232）（DPYILLVSSKVSTVKDLL） （DL18）為動脈粥樣硬化患者出現(xiàn)抗HSP65抗體頻率最高的幾個B細胞表位之一。選擇以上兩個B細胞表位，合成制備表位肽，通過皮下免疫高脂誘導的新西蘭大白兔研究其對AS的皮下免疫效果，進一步研究HSP相關表位與AS之間的關系。前期研究利用HSP65中的T和B細胞表位構建的多肽疫苗經(jīng)粘膜免疫后降低AS斑塊形成的效果并不理想，本研究單獨觀察HSP65上的B細胞表位皮下免疫后致AS結果，基于此結果，進一步研究設計出可通過粘膜免疫的抗AS斑塊形成的表位多肽疫苗，通過研究HSP重要功能表位與AS之問的關系，為抗AS多肽抑制劑的設計提供理論及實驗基礎。

將EE14與DL18合成肽通過戊二醛溶液法分別與牛血清白蛋白（bovine serum albumin， BSA）偶聯(lián)制備成偶聯(lián)蛋白，以提高表位抗原肽的免疫原性，并與弗氏不完全佐劑制備成乳劑，塒高脂膳食誘導的患AS新西蘭大白兔進行皮內(nèi)皮下聯(lián)合免疫，測定動脈粥樣斑塊的大小，血清中總膽同醇含量變化及抗HSP65抗體產(chǎn)生情況及變化趨勢，研究HSP65功能表位肽在弗氏不完全佐劑條件下經(jīng)皮下免疫是否加重動脈粥樣硬化病情。

1 材料和方法

1.1 試劑、融合蛋白與動物

EE14和DL18由上吉爾?；ㄉ虾＃┯邢薰竞铣??？紤]單純合成的多肽免疫原性很低，所以研究中將多肽與BSA通過戊二醛偶聯(lián)成偶聯(lián)蛋白來加以免疫，以克服單純的合成多肽片段難以激發(fā)免疫反應的不足。

膽同醇純度>99.9%（上海生工）；弗氏不完全佐劑（Freund's adjuvant incomplete， IFA） （Sigma.USA）；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG（武漢博士德生物工程有限公司）；總膽固醇（total choles-terol， TC）測定試劑盒（上海榮盛生物技術有限公司）；其余為常規(guī)試劑，國產(chǎn)AR級。

新西蘭大白兔購自江蘇省農(nóng)業(yè)科學研究院，雄性，體重1.5—2.0 kg，置于一般室內(nèi)環(huán)境單籠飼養(yǎng)

1.2 方法

1.2.1 多肽與BSA偶聯(lián)

戊二醛作為一種雙功能偶聯(lián)劑，其兩個醛基通過結合賴氨酸殘基上的游離氨基，把不同抗原連接起來。合成表位肽EE14與BL18和BSA各5 mg溶解于PBS.混勻，邊攪拌邊向混合液緩慢滴加0.25% PBS稀釋的戊二醛溶液，放置于低溫條件下過夜反應。第2 d觀察生成的偶聯(lián)物，若溶液變?yōu)榈S色，則逐滴加入l mol/L PBS稀釋的甘氨酸溶液，在低溫條件下終止此反應30 min后，將偶聯(lián)液以1：20的比例對PBS透析，6h左右換透析液，隨后再更換3次透析液（每隔12 h一次）。冷凍干燥，-20 ℃保存。

1.2.2 新西蘭大白兔動脈粥樣硬化模型的建立和免疫

新西蘭大白兔隨機分為3組，分別為PBS、EE14及DL18免疫組。其中PBS組9只，其余兩組各8只。各組新西蘭大白兔飼喂高膽固醇食物，每只兔每天的膽同醇攝人量為0.5 g（飼料配方為0.5%的膽固醇，5%的油脂與94.5%的基礎飼料），前后高脂飼料飼喂共5個月左右，直至實驗結束時PBS組新兩蘭大白兔腹主動脈中有明顯的粥樣斑塊生成。各組藥物均以滅菌PBS溶解，與IFA一起等量配制成0.2 mg/mL濃度，免疫劑量為每只200 μg，注射體積為每只1mL。皮內(nèi)皮下多點注射的方法免疫新西蘭大白兔，背部4點皮內(nèi)注射，頸部l點皮下注射，自造模開始，免疫4次，前4個月每月免疫1次，第一次免疫在高脂喂養(yǎng)2周后。各組分別于免疫的第0、3、5、8、Il、14、18、22周耳緣靜脈取全血，靜置1 h左右，低溫條件下4 000 t/min進行離心，取上清，放置冰箱-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 覓體征變化情況

實驗過程中肉眼觀察新西蘭大白兔的外觀、行為、活動、攝食量、體重、糞便及眼、耳、皮膚等器官的情況，最后在解剖新西蘭人白兔取出主動脈過程中觀察心、肝、脾、肺、腎等內(nèi)臟器管的變化。1.2.4 抗HSP65、抗EE14與抗DL18抗體（lgG）的ELISA檢測

用不同的包被抗原包括純化的HSP65或EE14. DL18包被酶標板，10μg/mL的抗原濃度溶于包被稀釋液，每孔加入100 μL，低溫條件下包被過夜：倒掉包被液，加2%BSA封閉液，低溫條件下封閉過夜；倒掉封閉液，加1：200稀釋的兔血清 1oo μL， 37℃進行孵育l h左右；去血清，用PBST與水交替洗滌6次后，加入1：20 000倍稀釋的酶標記的羊抗兔IgG，孵育。倒去酶標二抗，PBST與水交替洗滌；加100 μL底物液，37℃反應45 min左右，加入H2S04終止反應，利用酶標儀測定OD450nm光密度值。

1.2.5 兔血清中總膽固醇含量檢測

利用榮盛牛物技術有限公司（上海）的TC檢測試劑盒，通過膽固醇氰化酶一過氧化物酶方法測定血清中的TC含量，利用可見分光光度儀于500 nm處測定吸光度，根據(jù)吸光度值，計算肌固醇含量（mmol/L） 。

1.2.6 兔腹主動脈粥樣病斑測定

新西蘭大白兔通過頸動脈放血的方法處死，從主動脈出心臟開始至髂動脈分義處分離出主動脈，將血管外面的脂肪組織小心剔除，后沿背側順剪開，用10%甲醛進行固定，4 d后用0.2%蘇丹Ⅲ（SudanⅢ）乙醇溶液進行染色半小時左右，70%乙醇溶液進行洗滌完全，將染色后的血管內(nèi)表面通過掃描儀進行掃描后，利用MarJlnfor7.0軟件統(tǒng)計斑塊而積與血管內(nèi)表皮的總面積。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將實驗數(shù)據(jù)用平均值±標準差（x±s）的形式表示。所有統(tǒng)計分析采用Student's t test，P<0.05被認為有顯著性差異。

2 結果

2.1 兔體征變化情況

實驗過程中肉眼觀察新西蘭大白兔的外觀、攝食量、體重、行為、活動、糞便及眼、耳、皮膚等器官的情況均未見異常變化。體重變化正常.逐日增加。

此外，對處死后兔的肝、脾、肺、腎等臟器，進上肉眼和顯微觀察，在外觀上這些臟器無明顯病變，無異常粘連物質(zhì)。

結果表明，2組多肽注射免疫組與PBS對照組相比，對新西蘭人門兔的生長并無明顯影響，除主動脈外其他的臟器無明顯異常。

2.2 抗HSP65、抗EE14與抗DL18抗體（IgG）的ELISA檢測

以HSP65蛋白為包被抗原。檢測PBD組、EE14、DL18免疫組血清中特異性抗HP65抗體的產(chǎn)生情況，檢測結果如下（圖1）。

在弗氏不完傘佐劑存在情況下，合成肽DLl8免疫組沒有誘導產(chǎn)生姒的抗Hsp65抗體，與PBS相比，沒有明顯差異而合成肽EEl4在第一次免疫后的第3周抗Hsp65抗滴度與 PBS組相比有所升高，隨后在第5周以后卻低于PBS對照組，且與PBS組差異不大，不具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），與PBS組未見有顯著差異（圖1）

以合成肽DL18蛋白為包被抗原，檢測PBS組，DLl8免疫組的血清中針對DL18合成肽抗體的的產(chǎn)生情況，檢測結果如下。在弗氏不完余佐劑存在的情況下，以合成肽DL18皮內(nèi)皮下免疫新西蘭大白兔，在第一次免疫后的第3周即可測得血清中抗DL18抗體的產(chǎn)生，并且與對照組相比差異顯著（P

以合成肽EE14蛋白為包被抗原，檢測PBS組.EEI4給藥組的血清中針對EE14合成肽抗體的產(chǎn)生情況，檢測結果如下。在弗氏不完全佐劑存在的情況下，合成肽EE14皮內(nèi)皮下免疫新西蘭大白兔，與PBS組相比，沒有誘導出針對抗EE14的抗體（圖3）。

2.3 免疫后兔血清TC的含量測定

利用上海榮盛生物技術有限公司的總膽同醇測定試劑盒，測得各組兔血清的總膽固醇含量見圖4。在弗氏不完全佐劑存在的條件下，EE14、DL18合成肽和PBS共同免疫新西蘭大白兔，從圖4可以看出，盡管后期（第22周最后一次取血測定）能影響血清中TC含量，但并無明顯的差異，無統(tǒng)計學意義，即兩組合成肽免疫組對新西蘭大白兔的血脂含量（TC）不會產(chǎn)明顯影響。從針對抗Hsp65抗體的產(chǎn)生情況看，與PBS組相比較兩組合成肽免疫組都未能誘導出高的抗Hsp65抗體.甚至還明顯低于PBS免疫組（圖1），這可能與其對TC含量不會產(chǎn)生影響有關。

2.4 新西蘭大白兔腹主動脈粥樣硬化斑塊測定結果

因膽固醇易被SudanⅢ染成紅色，而粥樣斑塊中富含膽固醇，因此經(jīng)染色后，斑塊部分則會與斑塊周圍正常血管部位區(qū)別開。利用軟件對粥樣斑塊的面積進行統(tǒng)計分析，PBS對照組粥樣斑塊面積為主動脈血管總面積的10.35%（圖5）；合成肽EE14和DL18與弗氏不完全佐劑免疫組主動脈粥樣斑塊面積分別占血管總面積的百分比分別為39.61和36.75%f圖6、7）。與PBS組比較，主動脈硬化斑面積與血管總面積百分比分別約為PBS組的3.8倍和3.6倍，與PBS免疫組相比有顯著性差異（P<0.05），具有統(tǒng)計學意義（圖8）。綜合以上結果，合成肽EE14與DL18在弗氏佐劑存在情況下經(jīng)皮下皮內(nèi)免疫新西蘭大白兔均能激發(fā)加強動脈粥樣硬化的斑塊生成

3 討論

許多研究發(fā)現(xiàn)HSP65/60是致動脈粥樣硬化因子，通過用從AS患者血清內(nèi)獲得抗體與健康人體獲得的抗體對mHSP65和hHSP60進行抗原掃描，發(fā)現(xiàn)兩者具有許多共有表位。用從卡介苗得到的mHSP65通過皮下注射免疫高脂膳食誘導的新西蘭大白兔能誘發(fā)AS，用重組的mHSP65肌注免疫后也能觀察到可明顯加劇AS，然而，用HSP65經(jīng)鼻粘膜途徑免疫高脂高膽固醇膳食新西蘭大白兔，發(fā)現(xiàn)結核分支桿菌HSP65經(jīng)粘膜免疫不僅不會加劇AS，反而能有效防止AS的發(fā)生和發(fā)展。提示在HSP65中存在AS相關的功能性表位肽段，這種表位在皮下注射免疫時會誘發(fā)AS，但通過粘膜免疫卻能激發(fā)旁路抑制，起到預防AS的作用。通過研究人與微生物HSP60/65的共有表位及各自特有表位是否能誘發(fā)動脈粥樣硬化，可為動脈粥樣硬化的免疫治療找到精確靶點，也能利用分棟出的表位肽段發(fā)展抗動脈粥樣硬化疫苗。前期研究中選擇了HSP65中的T和B細胞表位構建多肽疫苗，經(jīng)粘膜免疫后降低AS斑塊形成的效果不明顯，原岡口JI能是免疫過程中存在T表位對B表位功能的掩蓋作用，因此本研究考慮利用直接合成B細胞表位后皮下注射免疫新西蘭大白兔，單獨觀察HSP65上的B細胞表位皮下免疫后是否能明顯增加AS斑塊生成，如果出現(xiàn)預期的結果，可利用這些B細胞表位，進一步構建設計出具有強的免疫原性的表位多肽，通過粘膜免疫方法進行免疫，進一步實驗研究出有效的抗AS疫苗。選擇的EE14為佐劑性關節(jié)炎疾病相關重要表位，DL18為動脈粥樣硬化患者出現(xiàn)抗HSP65抗體頻率最高的幾個B細胞表位之一，本研究中將表位與BSA偶聯(lián)制備成偶聯(lián)蛋白加以免疫以激發(fā)顯著的免疫反應，結果表明兩表位確實能加劇AS粥樣硬化斑塊的生成。

有研究表明，HSP65抗體水平的提高與AS和冠心病及臨界高血壓有關，HSP65/60抗體在AS的初始階段通過自身免疫機制發(fā)揮作用?！氨砦粩U展”是直接致病抗體缺乏情況下，抗原特異性B淋巴細胞促進疾病發(fā)生的重要機制，B淋巴細胞能通過提高遞呈的效能和多樣性促進疾病發(fā)展，在持續(xù)的免疫應答過程中，免疫系統(tǒng)可對隱蔽抗原表位相繼發(fā)生免疫應答，即個別表位免疫后能誘導出針對大分子的抗體。在弗氏不完全佐劑仔在下進行免疫，以HSP65蛋白為包被抗原，DL18和EE14兩組都未檢測出有明顯的抗HSP65抗體的產(chǎn)生，可能是HSP65分子太大，上面包含了大量的T或B細胞，而我們的合成肽片段太小，上面的表位太少，而難以誘導出針對整個大分子的抗體，說明單獨的小分子表位肽段免疫過程中未出現(xiàn)所謂的“表位擴展”，即未擴展到針對HSP65的其他表位的免疫反應。兩組分別以DL18和EE14為包被抗原，結果顯示DL18免疫組在第一次免疫后的第3周即可測得血清中抗DL18抗體的產(chǎn)生，差異顯著，具統(tǒng)計學意義（P

在血脂方面，EE14、DL18合成肽和PBS共同免疫新西蘭大白兔，兩組盡管后期能影響血清中TC含量，使之稍有升高，但并無明顯的差異，即兩組合成肽免疫組對新西蘭大白兔的血脂（TC）含量沒有產(chǎn)生明顯影響。從抗HSP65抗體的產(chǎn)生情況看，與PBS組相比較兩組合成肽免疫組都未能誘導出高的抗HSP65抗體，無明顯差別。結合項目前期研究結果，出現(xiàn)高的抗HSP65抗體組同時也伴隨高的血清TC含量，推測抗HSP65水平可能與對TC含量的影響有關。

從粥樣硬化斑塊占整個主動脈血管的面積比上看，合成肽DL18和EE14兩免疫組都可明顯加重AS斑塊生成，其斑塊面積與主動脈血管總面積百分比分別為36.75%與39.61%，約為PBS組的3.6倍和3.8倍，與PBS免疫組相比有顯著性差異，具有統(tǒng)計學意義fP<0.05），因此合成肽EE14與DL18在弗氏佐劑存在情況下經(jīng)皮下皮內(nèi)免疫新西蘭大白兔均能激發(fā)加強動脈粥樣硬化的斑塊生成。和前人研究結果之HSP65及其相關表位皮下注射免疫能加重AS保持了一致，表明所選擇的表位在誘導免疫反應及增加AS斑塊形成過程中起著重要作用，但作用機制需進一步研究。

綜上研究結果，盡管從抗體生成角度和血脂水平還不能明確其加重AS斑塊形成的機制，但通過所選表位經(jīng)皮下免疫確實能誘發(fā)斑塊加劇生成的結果。結合前面提到在HSP65分子中存在AS相關的功能性表位肽段皮下注射免疫是誘發(fā)加重AS斑塊生成，可通過粘膜免疫卻能激發(fā)旁路抑制，起到預防AS的作用。在后續(xù)實驗中可以考慮基于這些B細胞表位設計出通過粘膜免疫方式進行免疫的抗AS疫苗，本課題也已在開展此方面的工作。再結合粘膜免疫的結果進一步研究這些表位的功能和免疫機制及進行抗AS斑塊生成的免疫調(diào)節(jié)劑的設計與開發(fā)研究。