馮夢(mèng)蝶 洪 愉 許澤仰 毛普加 馮 金 趙繼華 楊洪文 宋武戰(zhàn) 黃 芬 井申榮 曾韋錕

摘 要：以CAT（chloramphenicol acetyltransferase，CAT）為報(bào)告基因，構(gòu)建pCAT2啟動(dòng)子探針我體從綠膿桿菌基因文庫(kù)中篩選啟動(dòng)子。Sau3A l酶切銅綠假單胞菌的基因組，回收（500—1 500bp）片段并與pCAT2載體連接構(gòu)建銅綠假單胞菌的基因組文庫(kù)，PCR鑒定文庫(kù)的多樣性，利用氦霉素（1 0μg/mL）和卡那霉素（50μg/mL）雙抗平板篩選了l6株陽(yáng)性菌株，并用PCR、測(cè)序、NCBI比對(duì)進(jìn)行鑒定。構(gòu)建的基因文厙的厙容鼉可達(dá)50 000個(gè)，覆蓋基因全長(zhǎng)的3.5倍，插入率達(dá)90%，具有較強(qiáng)的隨機(jī)性。采用雙抗平板進(jìn)行啟動(dòng)子的篩選，篩選效率高達(dá)96%。獲得了綠膿桿菌基因組中的9個(gè)啟動(dòng)子，同源性達(dá)99%以上，并對(duì)其活性進(jìn)行初步鑒定，為銅綠假單胞菌基因表達(dá)調(diào)控的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT）；報(bào)告基因；銅綠假單胞菌（PA）；啟動(dòng)子文厙

中圖分類(lèi)號(hào)：R37

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-7847（2014）06-0521-06

氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（Chloramphenicol acetyl-transferase，CAT）是一種原核酶類(lèi)，含有CAT的細(xì)菌暴露在氯霉素中可以使其乙?；セ钚裕@是某些細(xì)菌抗氯霉素的主要原因，該酶能在大腸桿菌中表達(dá)，且非常穩(wěn)定，是常用的報(bào)告基因之一。

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruguzosa，PA）義名綠膿桿菌，是一種廣泛存在于自然界的革蘭氏陰性條件致病菌，當(dāng)機(jī)體免疫機(jī)能低下時(shí)可引起多種感染。近年來(lái)，對(duì)人的致病作用明顯增加，是一系列嚴(yán)重的化膿性感染，尤其是支氣管擴(kuò)張、慢性支氣管炎、囊性肺纖維化等疾病繼發(fā)感染的重要致病菌，是病人在住院期問(wèn)感染的第3大致病菌。

細(xì)菌進(jìn)入機(jī)體并生存下來(lái)需要一定的適應(yīng)機(jī)制，其中涉及調(diào)控元件如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子等。而在這些調(diào)控元件中，啟動(dòng)子是位于編碼基因上游與RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合的一段特殊DNA序列，起著“開(kāi)關(guān)”的作用。因此，本研究以CAT為報(bào)告基因構(gòu)建了一個(gè)缺乏啟動(dòng)子的探針載體，構(gòu)建綠膿桿菌基因組文庫(kù)從中“釣取”啟動(dòng)子片段，并對(duì)啟動(dòng)子的活性進(jìn)行初步鑒定，為進(jìn)一步研究銅綠假單胞菌的基因調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體

感受態(tài)大腸桿菌DH5α，銅綠假單胞菌（ATCC27853），質(zhì)粒pACYC184、pPhoA、pET -MR均為昆明理工的大學(xué)基因工程與制藥實(shí)驗(yàn)室保存，pMD18-T購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.2 工具酶和主要試劑

限制性?xún)?nèi)切酶（SalI、Xho I、S（LCI、BglⅡ）、DL DNAmarker2000、DL DNAmarker5000、T4 DNA連接酶均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)白北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司。RNaseA購(gòu)白生工生物工程（上海）股份有限公司。蛋白酶K購(gòu)自Fermentas（加拿大）公司。Taq DNA聚合酶I購(gòu)白天根生化科技（北京）有限公司。LB培養(yǎng)基：酵母粉5 g.胰蛋白胨10 g，NaCl 10g，定容至l L（固體加2%的瓊脂）?？敲顾?、氯霉素、氨芐青霉素、PCR試劑均購(gòu)白生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CAT基因擴(kuò)增

引物的設(shè)計(jì)：參考pACYC184載體中CAT序列設(shè)計(jì)引物，在引物上下游分別引入Nde I、Xho I酶切位點(diǎn)，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，序列見(jiàn)表l。

目的片段的擴(kuò)增：用引物1和引物2，以pA-CYC184質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增CAT基因。PCR參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s；50 ℃復(fù)性30 s、72 ℃延伸40 s，循環(huán)35次；72℃總延伸5min。采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，小量瓊脂糖凝膠試劑盒純化目的片段。T-A克隆至pMD18-T，獲得pMD18-T-CAT，用Nde I和Xho I雙酶切鑒定，并送華大基因測(cè)序。

1.2.2

pCAT2載體的構(gòu)建

測(cè)序正確后，Nde I 、Xho I雙酶切pMD18T-CAT，回收小片段。pER-MR載體（圖1）用限制性?xún)?nèi)切酶Nde I和Xho I雙切，膠回收載體大片段二將兩者用T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，kan+抗性平板篩選。隨機(jī)挑選平板上長(zhǎng)出的單個(gè)菌落接種于LB液體培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)后提質(zhì)粒，雙酶切鑒定。鑒定正確的載體命名為pCAT2。

1.2.3 銅綠假單胞菌基因組提取、酶切與回收

從-80 ℃冰箱中取出保存的銅綠假單胞菌，室溫融化后取50μL菌液加入到盛有5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的中晚期時(shí)收獲細(xì)菌，提取細(xì)菌基因組DNA，具體過(guò)程如下：取5 mL銅綠假單胞菌12 000 r/min離心1min，沉淀用567 μL TE重懸，然后加入30 μL，10% SDS、3 μL 20 mg/mL蛋白酶K混勻，37 ℃溫育l h：再加80 μL 3mol/L CTAB/NaCl允分混勻，于65℃溫育10 min；加入等體積的氯仿/異戊醇混勻，l2 000 r/min離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的EP管中；再加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，混勻，12 000r/min離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的EP管巾；加入0.6倍體積的異丙醇，輕輕混勻，有絮狀沉淀出現(xiàn)，12 000 r/min離心10 min，棄上清；沉淀用70%和無(wú)水乙醇各洗一次后晾干，用100 μL TE重懸、定量。用Sau3A I酶切銅綠假單胞菌基因組DNA，最佳條件的摸索如表2所示。在最佳酶切條件下大量酶切，1.5%瓊脂糖電泳回收500—1 500 bp的片段。

1.2.4銅綠假單胞菌基因組文庫(kù)的構(gòu)建與鑒定

將含有質(zhì)粒pCAT2的大腸桿菌DH5a接種于含有50μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，按照質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。pCAT2載體用BglⅡ酶切、去磷酸化，凝膠回收。采用T4 DNA連接酶將去磷酸化的載體與綠膿桿菌基因組隨機(jī)片段按摩爾比為1：5的比例16 ℃過(guò)夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)中，涂布于Kan+抗性平板篩選，計(jì)數(shù)平板上的菌落。隨機(jī)挑選16個(gè)菌落，以引物2和引物3進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增DNA片段，鑒定插入片段的隨機(jī)性。PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性15 min；94℃變性30 s；50℃復(fù)性30 s、72 ℃延伸90 s，循環(huán)35次；72 ℃總延伸I0 min。將PCR產(chǎn)物在含有溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，用凝膠成像儀分析系統(tǒng)分析處理。

1.2.5 啟動(dòng)子文庫(kù)的構(gòu)建與篩選

收集上述平板上所有菌落于含有LB培養(yǎng)基的無(wú)菌EP管中，按質(zhì)粒小量抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒DNA，得到含銅綠假單胞菌基因組DNA隨機(jī)片段的質(zhì)粒庫(kù)，即為啟動(dòng)子文庫(kù)。然后將混合質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，同時(shí)以沒(méi)有插入制綠假單胞菌基因組DNA隨機(jī)片段的空載體質(zhì)粒為對(duì)照?？敲顾兀?0μg/mL）和氯霉素（10μg/mL）雙抗平板篩選具有啟動(dòng)子活性的陽(yáng)性菌株。

1.2.6 啟動(dòng)子的鑒定

pCAT2重組質(zhì)粒是缺失啟動(dòng)子，如果在Bgl II位點(diǎn)插入的DNA片段具有有啟動(dòng)子活性，則某些菌落能表達(dá)CAT因此能夠抗一定濃度的氯霉素。經(jīng)過(guò)雙抗平板篩選的陽(yáng)性單克隆，初步說(shuō)明插入的DNA片段具有啟動(dòng)子的功能。隨機(jī)挑選10個(gè)單菌分別接種于5 mL含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃過(guò)夜振蕩培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，PCR鑒定后，用引物2和引物3進(jìn)行雙向測(cè)序，分析插入片段的平均長(zhǎng)度，將測(cè)序結(jié)果上傳到Internet（http：//www.ncbi.nlm.gov/BLAST/）上與銅綠假單胞菌傘基岡組序列做Blast分析。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增CAT

pCAT2載體包含來(lái)自于pACYC184的CA71報(bào)告基因、pBR322的復(fù)制起始位點(diǎn)和卡那霉素抗性基因。CAT基因的PCR結(jié)果如圖2所示。PCR產(chǎn)物經(jīng)T-A克隆至pMD18-T，經(jīng)Nde I和Xho I雙切，因pMD18一T載體自身含有一個(gè)Nde I酶切位點(diǎn)，切出 3個(gè)片段：載體骨架、預(yù)期目的片段和小片段，切出片段的大小為678 bp，符合預(yù)期值（圖3）。測(cè)序結(jié)果經(jīng)比塒與pACYC184的CAT序列完全一致。

2.2

pCAT2載體的鑒定

雙酶切后插入pER-MR 中構(gòu)成pCAT2載體重組子經(jīng)Nde、Xho I雙酶切后，得到兩個(gè)大小不同的片段，大片段人小5.2 kh，為載體片段，小片段為插入片段，大小均符合預(yù)期值（圖4），表明pCAT2載體構(gòu)建成功。

2.3 銅綠假單胞菌基因組酶切條件的探索

為了獲得500～1 500 bp的銅綠假單胞菌基因組DNA隨機(jī)片段，用Sau3A I進(jìn)行部分酶切時(shí)，需要調(diào)整酶量、反應(yīng)時(shí)間以選擇最佳酶切反應(yīng)條件。實(shí)驗(yàn)摸索表明要獲得500～1 500 bp的DNA片段，最適酶濃度為0.2 U/μL，反應(yīng)時(shí)間l h （圖5）。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行大量酶切，膠回收500—1 500 bp范圍的DNA片段。

2.4 啟動(dòng)子文庫(kù)質(zhì)量的鑒定

銅綠假單胞菌的基因組全長(zhǎng)約為6.3 Mb，文庫(kù)獲得約50 000個(gè)克隆，捅入片段平均大?。?00 bp），質(zhì)粒文庫(kù)大約覆蓋基因組全長(zhǎng)的3.5倍（50 000x900 bp/6.3 Mb/2）。隨機(jī)挑取的16個(gè)陽(yáng)性單克隆中，有14個(gè)克隆PCR產(chǎn)物含有插入片段，文庫(kù)插入率達(dá)到90%左右，PCR結(jié)果見(jiàn)圖6。隨機(jī)抽取10個(gè)含有插入片段質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物（引物為P2、P3），其中9個(gè)質(zhì)粒插入片段平均長(zhǎng)度為約900 bp（圖7）。將測(cè)序與銅綠假單胞菌基因組序列做Blast分析，結(jié)果9個(gè)片段與綠膿桿菌全基因組序列吻合，同源性99%以上，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

銅綠假單胞菌是病人在住院期問(wèn)再次感染的主要病原菌之一。其中代謝性疾病、血液病和惡性腫瘤的患者，以及術(shù)后或某些治療后的患者易感染本菌。經(jīng)常導(dǎo)致術(shù)后傷口感染，也可引起褥瘡、膿腫、化膿性中耳炎等。本菌引起的感染病灶可血行播散，發(fā)生菌血癥和敗血癥。燒傷后感染銅綠色假單胞菌嚴(yán)重者可死亡。

啟動(dòng)了探針載體是分離和測(cè)定啟動(dòng)子效率的主要工具，通常借助于易檢測(cè)的報(bào)告基因來(lái)完成。目前在細(xì)菌研究中常用的報(bào)告基因有抗性基因和非抗性基因。為了研究銅綠假單胞菌的基因表達(dá)和調(diào)控，本研究構(gòu)建了pCAT2啟動(dòng)子探針載體，在綠膿桿菌基因文庫(kù)中篩選啟動(dòng)子，并成功獲得9種啟動(dòng)子。

氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶可催化乙酰CoA的乙?；D(zhuǎn)移到氯霉素3羥基，而使氯霉素分解，從而使得宿主菌能住含有氯霉素的條件下生長(zhǎng)。目前CAT廣泛應(yīng)用于哺乳細(xì)胞瞬時(shí)性表達(dá)，也可進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡和免疫組織化學(xué)等方面的分析。

本研究以CAT作為報(bào)告基因，將銅綠假單胞菌基因文庫(kù)構(gòu)建到pCAT2載體上，使基因文庫(kù)隨機(jī)插入，在沒(méi)有DNA片段插入時(shí)，CAT是不能表達(dá)的，只有在CAT前插入啟動(dòng)子，才能使其表達(dá)表現(xiàn)出抗氯霉素的特性。實(shí)驗(yàn)中利用雙抗篩選出能夠生長(zhǎng)的陽(yáng)性單菌，說(shuō)明有銅綠假單胞菌啟動(dòng)子的插入，并能使CAT表達(dá)，表現(xiàn)出抗氯霉素的特性，初步說(shuō)明插入的DNA片段具有肩動(dòng)子活性。

文庫(kù)的容量是衡量文庫(kù)的質(zhì)量的重要標(biāo)準(zhǔn)按照公式N=ln（l—P）/ln（1-f），其中N是轉(zhuǎn)化成功的單克隆數(shù)，P是覆蓋率，f是插入片段大小與其因組DNA大小的比值。銅綠假單胞菌基因組隨機(jī)片段的平均人小約為900 bp，銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組全長(zhǎng)約為6.3 Mb，若要求插入DNA片段在文庫(kù)中出現(xiàn)的概率為99%，所需轉(zhuǎn)化成功的菌落數(shù)約為32 227個(gè)，我們總共獲得約50 000個(gè)克隆，我們構(gòu)建的文庫(kù)約覆蓋基因的3.5 倍，并且90%左右還有隨機(jī)插入片段，表明文庫(kù)質(zhì)量較好

本研究使用CAT作為篩選標(biāo)記，用雙抗來(lái)篩選.效率高達(dá)96%，從而簡(jiǎn)化了篩選過(guò)程，工作量也大幅度下降。從理論上說(shuō)，文庫(kù)菌在雙抗平板上長(zhǎng)出的單克隆則表明插入片段含有啟動(dòng)子。我們挑取9個(gè)進(jìn)行測(cè)序分析，對(duì)應(yīng)插入基因信息如表3所示，其中3～8號(hào)分別包含核酸外切酶、未知功能DUF1654蛋白、蛋氨酸亞砜還原酶B、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、3-氧代?；?ACP還原酶，且插入方向與報(bào)告基因CAT方向一致，這與預(yù)期相符。其他4個(gè)插入片段的插入方向與CAT的方向相反。反復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)這些菌落在雙抗平板上能夠生長(zhǎng)，甚至氯霉素的濃度為34μg/mL時(shí)仍能正常生長(zhǎng)，因此我們推測(cè)這些插入片段中可能含有未被發(fā)現(xiàn)或注釋的強(qiáng)組成型肩動(dòng)子，這有待下一步驗(yàn)證。

綜上所述，本文以pCAT2為啟動(dòng)子探針載體，構(gòu)建了銅綠假單胞菌的隨機(jī)啟動(dòng)子文庫(kù)，在初步實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上為下一步深入研究銅綠假單胞菌基因功能與調(diào)控以及致病性等研究奠定了良好基礎(chǔ)。