辛穎 奧烏力吉 王麗梅 趙麗

【摘 要】 目的 本研究擬在內(nèi)蒙古通遼地區(qū)的蒙古族人群中驗證血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）受體2（KDR）基因多態(tài)性與冠心病的關(guān)聯(lián)。方法 研究對象為2010年1月至2011年10月通遼市疾病預(yù)防控制中心收集的400例樣本，其中包括200例健康的蒙古族對照人群和200例蒙古族冠心病患者。采用PCR聯(lián)合限制性內(nèi)切酶消化的方法對目的基因進行分型，并通過抽樣測序以驗證PCR-酶切方法的準確性。ELISA方法檢測血漿中KDR的水平。結(jié)果 KDR的3個SNP位點均與蒙古族冠心病的易感度相關(guān)，其中SNP-604的OR=1.45（P<0.05），SNP1192的OR=1.42（P<0.05），SNP1719的OR=1.49（P<0.05）。ELISA結(jié)果顯示SNP-604CC基因型攜帶者血漿中KDR蛋白水平顯著低于SNP-604TT基因型攜帶者。與對照組相比，冠心病組KDR蛋白水平表達增加，與CRP表達水平成正比。結(jié)論 KDR的SNP-604、SNP1192和SNP1719與蒙古族冠心病遺傳易感性相關(guān)，其作用機制主要是通過調(diào)節(jié)KDR的表達去影響KDR與VEGF結(jié)合率。

【關(guān)鍵詞】 KDR；變異；冠心??；蒙古族

【中圖分類號】 R541.4 【文獻標識碼】 A

冠心病的發(fā)生是多種危險因素長期相互作用的共同結(jié)果。在冠心病的各個發(fā)病學(xué)說中，血管內(nèi)皮細胞的功能失調(diào)幾乎均有涉及，它被認為是冠心病發(fā)病進程中最重要的始動環(huán)節(jié)[1]。血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）及其受體系統(tǒng)在血管生成和內(nèi)皮損傷修復(fù)過程中起到非常重要的作用[2]。KDR作為2型VEGF受體，主要表達于內(nèi)皮細胞中，與VEGF結(jié)合后主要在血管的生成和修復(fù)中起關(guān)鍵作用。有研究顯示，VEGF及KDR參與冠狀動脈粥樣硬化的全過程[3]。我們通過查找相關(guān)數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)KDR基因上含有多個SNP位點，通過生物信息學(xué)提示得出某些SNP位點可能影響蛋白分子VEGFR2的表達情況及功能，即KDR的基因多態(tài)性可能與冠心病的發(fā)生與發(fā)展相關(guān)。我們選取KDR基因啟動子區(qū)的多態(tài)性位點SNP-604以及編碼區(qū)的多態(tài)性位點SNP1192和SNP1719，旨在研究這些SNP位點在蒙古族冠心病患者的個體遺傳易感度。

1 材料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 樣本的入選 病例-對照人群樣本來源于通遼市疾病預(yù)防控制中心在2010年1月至2011年10月收集的200例蒙古族冠心病患者和200例蒙古族健康對照。入選標準包括冠心病患者均通過冠狀動脈造影檢查確認，至少有一支冠狀動脈狹窄大于50%。對照組人群的冠狀動脈狹窄沒有超過20%，并且沒有其他的血管性疾病。

1.1.2 問卷調(diào)查和血標本采集 經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的工作人員對每一位冠心病患者和健康對照人群進行標準問卷調(diào)查，由本人或家庭成員接受問卷調(diào)查。問卷調(diào)查的內(nèi)容主要包括被調(diào)查者的飲食、生活習(xí)慣（包括是否吸煙、飲酒等）、高血壓史及服降壓藥史、神經(jīng)疾病史、糖尿病史等。經(jīng)過詳細的體征測量后，取尿和空腹血，檢測相關(guān)的生化指標。

1.2 基因測定 采用PCR聯(lián)合限制性內(nèi)切酶消化的方法檢測各樣本KDR的SNP位點。詳細信息見表1。

1.3 ELISA方法檢測血漿KDR蛋白水平 為了分析KDR基因的SNP-604位點對血漿KDR水平是否有影響，本研究隨機選擇24個健康對照的血漿，使用ELISA方法檢測血漿中KDR蛋白的濃度。24個樣本的基因型分別是8個TC，8個TT，8個CC。實驗步驟按試劑盒的說明書進行操作。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)由SPSS13.0軟件統(tǒng)計，顯著性水平P值定為0.05（雙側(cè)）。計量資料用平均值±標準差表示，采用獨立樣本t檢驗進行統(tǒng)計；計數(shù)資料用事件的比例表示，采用X2檢驗進行統(tǒng)計。利用卡方檢驗評價基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡；計算所有SNPs的等位基因頻率和基因型頻率在病例組和對照組的分布，并進行每個SNP位點的單位點關(guān)聯(lián)分析；采用多因素Logistic回歸模型調(diào)整傳統(tǒng)的心血管危險因素后分析不同基因型與冠心病的關(guān)聯(lián)，并計算出調(diào)整后的相對危險度和95%可信區(qū)間。

2 結(jié)果

2.1 人群一般臨床資料 病例-對照人群的主要臨床資料如表2所示，在蒙古族的冠心病樣本中患糖尿病、患高血壓以及吸煙等指標均明顯高于健康對照組（P<0.01）。

2.2 ELISA方法檢測血清KDR蛋白水平 應(yīng)用ELISA分析方法得出SNP-604CC基因型攜帶者血清中KDR蛋白水平顯著低于SNP-604TT。結(jié)果見表3。

2.3 KDR基因的三個SNP位點的基因型頻率與冠心病的關(guān)聯(lián)分析 KDR的基因型頻率分布見表4，均符合Hardy-Weinberg平衡。通過統(tǒng)計，我們發(fā)現(xiàn)KDR的3個SNP位點，當(dāng)只攜帶一個危險等位基因型時，其發(fā)病風(fēng)險顯著高于不攜帶危險等位基因的人，但是與攜帶2個危險等位基因的純合子相比，又無明顯差異，提示目前存在著顯性遺傳效應(yīng)。當(dāng)采用顯性模型來分析這3個SNP位點與蒙古族冠心病的關(guān)聯(lián)時，我們發(fā)現(xiàn)在冠心病病例組中，所有這3個SNP的攜帶危險等位基因的純合子基因型和雜合子基因型頻率均顯著高于正常對照組，利用多因素Logistic回歸模型對年齡、性別、吸煙、飲酒等危險因素進行校正以后，這種相關(guān)性依然存在。

對SNP-604：M=T，m=C；對SNP1192：M=G，m=A；對SNP1719：M=T，m=A

3 討論

病例-對照研究結(jié)果顯示KDR基因3個SNP位點SNP-604、SNP1192、SNP1719均與蒙古族冠心病的遺傳易感度相關(guān)。在校正一些傳統(tǒng)的冠心病危險因素后，這3個SNP與蒙古族患冠心病的相關(guān)性依然存在，說明這3個SNP位點可以作為蒙古族冠心病獨立的危險因素，即攜帶突變型等位基因的蒙古族具有更高的冠心病遺傳易感性。

內(nèi)皮細胞損害或者功能障礙可以導(dǎo)致冠心病的發(fā)生，體內(nèi)異常血管的生成亦可增加冠心病的風(fēng)險[4]。VEGF和KDR通過很多作用機制去參與影響冠心病的發(fā)病過程[5]。本研究中關(guān)于KDR基因的三個SNP位點，其基因型的頻率分別與HapMap數(shù)據(jù)庫中報道的數(shù)據(jù)一致。KDR基因SNP-604T>C可以下調(diào)KDR的mRNA水平，進而降低血清中KDR蛋白的水平。SNP1192G>A和SNP1719T>A位點均可以影響VEGF與KDR的結(jié)合效率，使其結(jié)合量少，結(jié)合效率低。通過本研究的實驗結(jié)果，我們可以推測KDR功能活性的降低與血管功能障礙有關(guān)（如內(nèi)皮細胞損傷、異常的血管修復(fù)等），可以促進動脈粥樣硬化性疾病的發(fā)生和發(fā)展過程。

4 結(jié)論

KDR基因上的3個多態(tài)性位點SNP-604、SNP1192和SNP1719通過影響KDR的表達和功能，與蒙古族患冠心病的遺傳易感度相關(guān)，這可作為內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族冠心病新的遺傳危險標記。

參考文獻

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[3] Barger AC，Beeuwkes R，Lainey LL，et al.Hypothesis：vasa vasorum and neovascularization of human coronary arteries.A possible role in the pathophysiology of atherosclerosis[J].N Engl J Med，1984，310：175-177.

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