湘玲 陳歡 劉衛(wèi)東 張暢 祝斌 王磊 李敏 周文 姚開泰 任彩萍

摘要：肝癌缺失基因-1（deleted in liver cancer-l，DLC-1）在多種腫瘤中呈現(xiàn)表達(dá)缺失或表達(dá)下調(diào)，這種異常表達(dá)主要與由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases.DNMTs）參與的啟動子區(qū)異常甲基化有關(guān)。RT-PCR結(jié)果顯示DLC-I在永生化鼻咽上皮細(xì)胞NP69和干擾DNMTs的5-8F細(xì)胞中的表達(dá)水平較未干擾的鼻咽癌細(xì)胞明顯升高。甲基化特異性PCR（methylation-specifiC PCR， MSPCR）結(jié)果則表明DLC-1啟動子區(qū)在表達(dá)下調(diào)或缺失的鼻咽癌細(xì)胞中均存在異常高甲基化，而干擾DNMTs后5-8F細(xì)胞中DLC-l啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)被逆轉(zhuǎn)，其中特異性干擾DNMT1后效果略為顯著，提示DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性對于鼻咽癌中DLC-1啟動子區(qū)甲基化水平具有重要的調(diào)控作用，而DNMT1的調(diào)控作用更為突出。

關(guān)鍵詞：DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）；肝癌缺失基因-1（DLC-1）；甲基化；RNA干擾

中圖分類號：Q786

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1007-7847（2014）04-0292-07

DNA甲基化（DNA methylation）是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）的催化作用下，將S-腺苷甲硫氨酸上的甲基添加在DNA分子中CpG二核苷酸的胞嘧啶堿基上。在哺乳動物中，甲基化轉(zhuǎn)移酶主要有4個成員，即DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L。DNMT1主要在DNA復(fù)制和修復(fù)中維持其甲基化，而DNMT3則是從頭合成甲基化酶，使得原來沒有甲基化的DNA甲基化，包含了DNMT3A、DNMT3B和一個調(diào)節(jié)蛋白DNMT3L，對于富含CpG片段的DNA，DNMT3A甲基化效率不高，但是它顯示出比其他甲基化酶更高的準(zhǔn)確性，有文獻(xiàn)證明DNMT3A與單拷貝基因的甲基化有關(guān)。相反，DNMT3B卻能快速甲基化富含CpG的片段，而DNMT3L因缺乏起催化作用的亞基，因而其本身并不具備甲基化酶活性，但能作為調(diào)節(jié)蛋白，協(xié)助DNMT3A和DNMT3B，共同進(jìn)行甲基化作用。

肝癌缺失基因一l（deleted in liver cancer-l，DLC-1）是由Yuan等于1998年通過代表性差異分析（representational difference， analysis， RDA）方法首次從肝臟組織中克隆獲得，是GTP酶激活蛋白（GTPase-activating protein，GAP）家族中的一員，通過激活Rho家族蛋白自身GTP酶活性而發(fā)揮作用。DLC-1基因在正常組織中廣泛表達(dá)，但在肝癌、胃癌、大腸癌、小細(xì)胞性肺癌、前列腺癌、多發(fā)性骨髓瘤等多種腫瘤中呈現(xiàn)表達(dá)缺失或表達(dá)下調(diào)，而且這種異常表達(dá)主要與等位基因雜合性丟失和啟動子區(qū)異常甲基化有關(guān)，而基因突變對于DLC-l的影響很小。在肝癌、乳腺癌、非小細(xì)胞性肺癌、前列腺癌和多發(fā)性骨髓瘤等腫瘤細(xì)胞中恢復(fù)表達(dá)DLC-1，發(fā)現(xiàn)該基因不僅能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而且還參與抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。

為進(jìn)一步研究DNA異常甲基化在DLC-1表達(dá)失活中的作用，考察DNMTs對DLC-1啟動子區(qū)異常甲基化的影響，我們在本研究中將采用RNAi技術(shù)，特異性地干擾鼻咽癌5-8F細(xì)胞內(nèi)DNMT1、DNMT34和DNMT3B后，分析DLC-1的啟動子甲基化狀態(tài)和表達(dá)情況。

1材料及方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞系

HNE1、HNE2、HNE3、CNE2為鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系；CNE1為鼻咽高分化鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系；5-8F、6-10B為鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系SUNE-1亞株，5-8F細(xì)胞系具有高成瘤、高轉(zhuǎn)移能力；6-10B細(xì)胞系則具有成瘤，不轉(zhuǎn)移特性；NP69為SV40T永生化鼻咽上皮細(xì)胞系；以上細(xì)胞系均為我所保存，于RPMI1640+1O%新生小牛血（newborn calf serum， NCS）的培養(yǎng)基中，37℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，呈上皮樣、貼壁生長。

1.1.2主要儀器

VDS紫外凝膠攝像儀購白美國Pharmacia公司；實時熒光定量PCR儀購自美國Bio一Rad公司；光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡購自日本Nikon公司；高速冷凍離心機及常溫離心機購自上海賽特離心機公司；-80℃冰箱、二氧化碳生化培養(yǎng)箱購自美國Forma Scientific公司；超凈工作臺購自江蘇蘇凈集團(tuán)安泰公司；電泳儀和電泳槽購自北京六一儀器廠。

1.1.3主要試劑/試劑盒

RPMI 1640、新生小牛血清、TRIzol試劑、瓊脂糖購自美國Invitrogen公司；DNase I酶購自瑞士Roche公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（A3500）、DNA抽提試劑盒（Wizard Genomic， DNA purification kit）購自美國Promega公司；Ex Taq（R）Hot Start Version酶購自大連寶生物公司；偏重亞硫酸鈉（SodiumMetabisulfite，S-1516，MW：190.13）、對苯二酚（hydroquinone，H-7148，MW：110.11），蛋白酶K購自美國Sigma公司；質(zhì)粒小提試劑盒（QIAGENPlasmid mini Purification Kit）、瓊脂糖凝膠回收試劑盒（Qiaquick Gel Extraction Kit，）購自德國QIA-GEN公司。

1.1.4引物

本文中所用RT-PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）引物序列南軟件設(shè)計，MSP（methy-lation-specific PCR，MSP）引物序列參照文獻(xiàn)，兩種引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。siRNA序列由廣州銳博生物科技有限公司合成，所用引物序列見表1。

1.2方法

1.2.1RNA的制備

取細(xì)胞1瓶，約1xl06個細(xì)胞，PBS液（pH7.2，0.01mol/L）洗滌2次，加入TRlzol l mL，反復(fù)吹打均勻；置冰上5min，加入氯仿0.2mL劇烈振搖15s，置冰上2min，11000r/min，4℃離心15min，吸取上層水相至另一新的DEPC處理的離心管中，加異丙醇0.5mL，置-20℃ 20min，11000r/min4℃離心15min，75%乙醇洗滌后用適量DEPC水溶解，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2細(xì)胞基因組DNA的提取

取細(xì)胞1瓶，約lxl06個，用D-Hanks液洗滌2～3次，0.25%胰酶消化，1000r/min離心5min收集細(xì)胞，PBS液（pH7.2，0.01mol/L）洗滌一次，1000r/min離心5min收集細(xì)胞，加入裂解液600μL（10mmol/L Tris-HCl pH8.0， 10mmol/L EDTA pH8.0，15mmol/L NaCl，0.4% SDS，100μg/mL蛋白酶K）；37℃過夜，等體積酚：氯仿（1：1）抽提2次，取上層于另一新1.5mL離心管中，加入2倍體積無水乙醇沉淀.70%乙醇洗滌2次，晾干，TE（pH8.0.含RNase酶20mg/mL）溶解，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3RT-PCR

總RNA按照Promega公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系組成為：10xReactionBuffer 2μL； MgCl2（25mmol/L）4μL；dNTPs（10mmol/L）2μL； RNasin （40μmol/μL） 0.5μL；AMV逆轉(zhuǎn)錄酶（20μmol/μL）1μL； Oligo （dT）lμL；RNA1～5μL（根據(jù)每個樣本RNA濃度不同，取1～5μL不等）；加入適量滅菌雙蒸水至總體積為20μL；反應(yīng)條件：42℃ 1h，99℃ 5min，置-20℃保存。其次，分別取1μL cDNA產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴增反應(yīng)，反應(yīng)體系組成為：lOXreaction buffer 2μL；MgCl2 （20mmol/L） 1.6μL； dNTPs （10mmol/L）0.4μL；primer （10μmol/L） 0.5μL； cDNA lμL；Taq酶（10U/μL） 0.2μL；反應(yīng)條件為：95℃ 5min， 94℃ 35s，52～58℃ 35s，72℃ 35s，30～35個循環(huán)，72℃ 10min。

1.2.4siRNA轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞

將生長在RPMI 1640（10%小牛血清）中的鼻咽癌細(xì)胞系5-8F，以（l～2）xl05的密度接種于六孔板中，24h后細(xì)胞匯合度達(dá)30%～50%。準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染混合液：A液（100μL）：3μL LipofectamineRNAiMAX （RNAiMAX）+97μL Opti-MEM；B液：5μL siRNA（終濃度為100nmol/L）+95μL Opti-MEM。混合A液和B液，室溫靜置20min，加入800μL無血清培養(yǎng)基，混合后將液體均勻滴加在細(xì)胞表面，5% CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)6～8h，吸去培養(yǎng)基，換上新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。72h后收集細(xì)胞，抽提RNA檢測干擾效果以及進(jìn)一步分析DLC-1的表達(dá)和啟動子甲基化狀態(tài)。

1.2.5亞硫酸鹽處理DNA

紫外光分光光度儀測定細(xì)胞樣本DNA的濃度和純度；將5μg基因組DNA溶于30μL TE；加入3.3μL臨時配制的3mol/L NaOH，室溫處理15min；將1.82g偏重亞硫酸鈉或者亞硫酸鈉（NaHSO3）溶于2.8mL雙蒸水中，加入430μL 3mol/LNaOH，加入210μL 10mmol/L對苯二酚，調(diào)pH值至5.0；在DNA中加入上述溶液333μL；加入礦物油3滴，于55℃水浴避光處理4h；將混合液用DNA純化試劑盒（Promega）純化后，溶于50μL滅菌雙蒸水中；加入5.56μL 3mol/L NaOH，37℃還原處理15min；加入33μL的10mol/L NH4Ac和3倍體積的無水乙醇，-20℃過夜使DNA沉淀：13000r/min，4℃，離心30min； 70%乙醇洗滌沉淀，13000r/min，4℃，離心10min；風(fēng)干沉淀，加入20μL TE溶解沉淀，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6MSP

反應(yīng)體系如下：lOXreaction buffer （Mg2+）2μL；dNTPs（2.5mmol/L）2μL；primers（甲基化特異性或非甲基化特異性上/下游引物）（10μmol/L） 0.5μL；Treated-DNA 2μL； Ex Taq HS（5U/μL） 0.1μL；滅菌雙蒸水12.4μL；反應(yīng)條件：95℃ 5min，95℃30s，56℃ 30s，72℃ 30s，40個循環(huán)；72℃延伸5min。

2結(jié)果

2.1RT-PCR檢測DLC-1在7株鼻咽癌細(xì)胞及1株永生化鼻咽上皮細(xì)胞NP69中的表達(dá)

以永生化鼻咽上皮細(xì)胞系NP69和慢性鼻咽炎組織為對照，以看家基因GAPDH為內(nèi)對照，經(jīng)差異RT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)在7株鼻咽癌細(xì)胞系中均未檢測到DLC-l的相應(yīng)條帶（圖1A），而在永生化鼻咽上皮細(xì)胞系NP69和4例慢性鼻咽炎組織中均可以檢測到明顯的DLC-1產(chǎn)物（圖1A、B）。

2.2 MSPCR分析DLC-1基因啟動子在鼻咽癌細(xì)胞系中的甲基化情況

將制備好的基因組DNA經(jīng)偏重亞硫酸氫鈉修飾后，作為PCR擴增模板，利用甲基化特異性引物擴增目的片段，分析甲基化情況。本實驗檢測了NP69細(xì)胞系、3例CN組織和7例鼻咽癌細(xì)胞系中基因DLC-1啟動子區(qū)甲基化的情況，發(fā)現(xiàn)在NP69細(xì)胞系和3例CN組織中，只檢測到了非甲基化產(chǎn)物，而在7例鼻咽癌細(xì)胞系中只檢測到了甲基化產(chǎn)物，結(jié)果提示，DLC-1啟動子在永生化鼻咽細(xì)胞系和3例CN組織中未發(fā)生甲基化，而在7株鼻咽癌細(xì)胞中發(fā)生了完全甲基化（圖2A）； MSPCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后進(jìn)行TA克隆并進(jìn)行測序分析，擴增的甲基化產(chǎn)物在CpG島處的C受到保護(hù)，經(jīng)亞硫酸鹽處理后，仍保留為C；而非甲基化產(chǎn)物在CpG島處的C全部變成T（圖2B）。測序結(jié)果進(jìn)一步驗證了MSPCR的結(jié)果。

2.3RT-PCR檢測甲基轉(zhuǎn)移酶DNMTs在鼻咽癌細(xì)胞系中的表達(dá)

RT-PCR方法檢測了DNMTl、DNMT3A和DNMT3B在7株鼻咽癌細(xì)胞系中的表達(dá)。結(jié)果顯示，3種DNMTs在7株鼻咽癌細(xì)胞系中均有不同程度的表達(dá)，而DNMT1和DNMT3B的表達(dá)高于DNMT3A（見圖3～5），其中DNMT1幾乎在7株細(xì)胞中的表達(dá)水平均高于DNMT3A和DNMT3B，而DNMT3B在7株細(xì)胞中的表達(dá)量均不高，甚至有些表達(dá)極其微弱。

2.4特異性干擾DNMTs對DLC-1表達(dá)的影響

根據(jù)文獻(xiàn)，我們篩選并合成能特異性干擾DNMTs表達(dá)的siRNA。 采用LipofettamineRNAiMAX作為轉(zhuǎn)染試劑，將3對siRNA分別轉(zhuǎn)入5—8F細(xì)胞，72h后收集細(xì)胞，抽提RNA和DNA，RT-PCR檢測每種siRNA的干擾效率、DLC-1基因表達(dá)水平以及MSP檢測CpG島的甲基化情況。結(jié)果顯示，與未處理對照組和非打靶對照組細(xì)胞相比，3個DNMTs表達(dá)明顯下降（圖4A），Bandleader軟件分析，3個基因表達(dá)均被抑制約70%。在特異性抑制3個DNMTs表達(dá)后，DLC-1都能重新表達(dá)，而以干擾DNMT1后表達(dá)較強（圖4B）。同時，在被干擾后的5-8F細(xì)胞中檢測到非甲基化產(chǎn)物（圖4C），這些結(jié)果表明，DNMTs對DLC—1啟動子區(qū)CpG島有一定的調(diào)節(jié)作用，在不同程度上影響了DLC-1的表達(dá)。

3討論

鼻煙癌是我國南方省份及東南亞國家或地區(qū)高發(fā)的一種上皮源性惡性腫瘤，具有明顯的種族聚集性和地域性。雖然目前對于鼻咽癌發(fā)病、早期診斷和治療方面已經(jīng)進(jìn)行了比較深入的研究，但鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的分子機制仍不甚清楚，而早期診斷和治療也未取得重大突破。DLC-1作為一個重要的抑瘤基因，自被發(fā)現(xiàn)開始，已有大量的研究小組對其失活機制及功能進(jìn)行了研究，Tripathi等發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌中DLC-1可以通過Rho蛋白信號通路，上調(diào)E-cadherin的表達(dá)抑制細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。Healy等在非小細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn)DLC-1可以通過依賴RhoGAP功能區(qū)域和不依賴RhoGAP功能區(qū)域兩種途徑來抑制細(xì)胞生長。Tripathi等 發(fā)現(xiàn)DLC-1通過與a-Calenin相互作用穩(wěn)定粘著連接來增強DLC-1抑瘤活性。本課題小組也通過一系列實驗證實了DLC-1在鼻咽癌中表達(dá)下調(diào)或缺失，它具有抑制鼻咽癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，影響細(xì)胞周期和細(xì)胞骨架形成等生物學(xué)功能。在此，我們也對鼻咽癌中DLC-1失活機制進(jìn)行了探討。

DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的表觀遺傳修飾之一，存在于所有高等動物體內(nèi)，對于維持正常細(xì)胞功能，遺傳印記及胚胎發(fā)育等過程有著極其重要的作用。由于DNA甲基化與人類發(fā)育和腫瘤疾病的密切關(guān)系，特別是CpG島甲基化所致抑瘤基因轉(zhuǎn)錄失活問題，DNA甲基化已經(jīng)成為表觀遺傳學(xué)和表觀基因組學(xué)的重要研究內(nèi)容。

在本研究中，我們首先通過RT-PCR檢測了3種甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMTl、DNMT3A和DNMT3B在7株鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，實驗表明，DN-MTs在這7株細(xì)胞中，均能表達(dá)，但是在不同的鼻咽癌細(xì)胞中表達(dá)量不同。其中DNMT1的mRNA的表達(dá)量高于DNMT3A和DNMT3B。而DNMT3A的表達(dá)量相較于其他兩種，則含量較低。為了進(jìn)一步證明3種甲基化轉(zhuǎn)移酶在DLC-1甲基化過程中如何發(fā)揮作用，我們利用RNAi技術(shù)，通過分別特異性干擾5-8F細(xì)胞中DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的表達(dá)，在三者的干擾效率均達(dá)到70%的情況下，均檢測到DLC-1的重新表達(dá)，同時其啟動子甲基化程度有所緩解。這些結(jié)果可以進(jìn)一步說明，DLC-1啟動子區(qū)的高甲基化與其在鼻咽癌中的表達(dá)下調(diào)或缺失有關(guān)。同時我們也發(fā)現(xiàn)，相對于干擾其他兩個DNMTs來說，DNMT1干擾后有比較明顯的逆轉(zhuǎn)效果，但總的來說，DLC-1重新表達(dá)的強度并不大，說明3種DNMTs聯(lián)合作用可能對于基因啟動子高甲基化的作用更明顯。

總之，本文首次通過實驗證實了在鼻咽癌中DLC-1的失活主要與DNA啟動子甲基化有關(guān)，且這種啟動子甲基化與DNMTs密切相關(guān)。這些為我們進(jìn)一步深入研究DLC-1在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用及分子機制奠定了良好的基礎(chǔ)。