楊清湖 白占濤

摘要：縫隙連接是胞間通道的集合體，是相鄰細(xì)胞間的跨膜通道。連接蛋白Cx29、Cx32和Cx46在施萬細(xì)胞中表達(dá)，Cx43在施萬細(xì)胞和衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)，并形成功能性的縫隙連接通道或半通道?？p隙連接蛋白直接或間接參與細(xì)胞信號整合，借助連接蛋白磷酸化及定向突變研究，其分子調(diào)控機(jī)制逐步清晰施萬細(xì)胞和衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞中連接蛋白及其磷酸化的闡明，有助于解釋其在外周神經(jīng)膠質(zhì)中的表達(dá)與功能調(diào)控。

關(guān)鍵詞：縫隙連接；施萬細(xì)胞；衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞；連接蛋白；磷酸化

中圖分類號：Q257

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1007-7847（2014）04-0353-05

縫隙連接（gap junction，GJ）是胞間通道的集合體，相鄰細(xì)胞間的跨膜通道，對胞間小于lkD小分子物質(zhì)轉(zhuǎn)換起門控作用，例如離子、第二信使（Ca2+、1P3、cAMP和ATP）、營養(yǎng)鹽和代謝物。脊椎動物中，縫隙連接是由頭對頭錨定在一起的半通道（也稱連接子）構(gòu)成，每一半通道由6個連接蛋白（connexin，Cx）構(gòu)成聚合體。每一Cx包含4個跨膜區(qū)（Ml-M4）、兩個胞外環(huán)和3個胞質(zhì)區(qū)（分別是C-端、胞質(zhì)環(huán)、N-端）。截止目前，已報道小鼠基因組中有20個連接蛋白基因家族成員（命名為Cja/Cjb/Gje），人類基因組中有21個（命名為GJA /GJB/CJE），其中小鼠連接蛋白基因中有19個與人類的存在直系同源，且高度保守，因此，其表達(dá)產(chǎn)物均常以Connexin表示?？p隙連接參與機(jī)體功能平衡、調(diào)節(jié)、再生和發(fā)展，如在增殖細(xì)胞、心臟細(xì)胞、肝細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞、晶狀體細(xì)胞等生理功能中均扮演重要角色，在外周神經(jīng)膠質(zhì)中更是承擔(dān)著核心調(diào)節(jié)功能。

外周神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞主要包括施萬細(xì)胞（Schwann cells，SCs）和衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞（satellite gliacells，SGCs）。SCs包裹在軸突外層，SGCs分布在神經(jīng)元周圍。SCs和SGCs在外周神經(jīng)系統(tǒng)中，通過縫隙連接維持神經(jīng)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、促進(jìn)突觸形成以及神經(jīng)信號調(diào)制。例如，損傷介導(dǎo)的Cx43可塑性是調(diào)停神經(jīng)敏化和放大疼痛反映的重要因素之一，Cx43抑制劑是神經(jīng)損傷的鎮(zhèn)痛劑。我們新近研究亦顯示，鞘內(nèi)注射縫隙連接阻斷劑顯著抑制蝎毒誘致的大鼠持續(xù)性自發(fā)痛、同側(cè)械痛敏等痛相關(guān)行為，以及DRG中Cx43、Cx36和Cx32mRNA的行為學(xué)相關(guān)時程表達(dá)。據(jù)此推測，縫隙連接參與疼痛且在痛發(fā)生發(fā)展機(jī)制中起重要作用：然而，目前有關(guān)外周神經(jīng)膠質(zhì)中縫隙連接，參與功能調(diào)控等方面的系統(tǒng)闡述尚少。因此，本文對縫隙連接蛋白在外周神經(jīng)膠質(zhì)中的表達(dá)、磷酸化以及其參與的功能調(diào)控進(jìn)行綜述，為今后進(jìn)一步研究縫隙連接及其潛在功能提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1縫隙連接蛋白在外周神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)

1.1縫隙連接蛋白在施萬細(xì)胞中的表達(dá)

Jessen等報道，成熟的SCs起源于多能神經(jīng)嵴細(xì)胞（neural crest cells，NCC），其成熟需經(jīng)歷兩個短暫階段：施萬細(xì)胞前體（Schwann cell precur-sors， SCPs）和未成熟施萬細(xì)胞（immature Schwanncells， ISCs）。目前發(fā)現(xiàn)Cx29、Cx32、Cx43和Cx46在SCs細(xì)胞中均有表達(dá)，其中Cx29和Cx32分布在SCs旁節(jié)（Paranodes）和施一蘭氏切跡（Schmidt-Lanterman incisures），但Cx29主要分布在鄰近軸突的SCs膜，特別是靠近旁節(jié)區(qū)。Cx32在旁節(jié)和施一蘭氏切跡形成縫隙連接，使得相鄰軸突與神經(jīng)元胞質(zhì)相連，形成胞間通訊。Cx43在NCC、SCPs和ISCs中均有表達(dá)，但在NCC中表達(dá)豐度較高，并在NCCs間形成縫隙連接通訊。同時，Cx43在SCPs胞質(zhì)中也大量存在，且貫穿整個SCs發(fā)育過程。神經(jīng)損傷后SCs中Cx46表達(dá)量上升，并且SCs的耦合、增殖與Cx46 mRNA和蛋白的表達(dá)水平密切相關(guān)，表明SCs間縫隙連接有助于細(xì)胞損傷應(yīng)答。

1.2縫隙連接蛋白在衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)

衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞（SGCs）是脊髓背根神經(jīng)節(jié)（dor-sal root ganglia， DRG）和三叉神經(jīng)節(jié)（trigeminalganglia，TG）中最重要的膠質(zhì)細(xì)胞類型。感覺神經(jīng)元是神經(jīng)信息處理位點之一，SGCs是感覺神經(jīng)元周圍的膠質(zhì)細(xì)胞，緊緊包裹在神經(jīng)元周圍允許小分子物質(zhì)透過。SGC與SGC間，SGC與神經(jīng)元胞體間，神經(jīng)元與神經(jīng)元間均有縫隙連接偶聯(lián)，但神經(jīng)元與神經(jīng)元間的偶聯(lián)程度遠(yuǎn)低于前兩種細(xì)胞間偶聯(lián)方式。Cx43在衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞中大量表達(dá)，Cx43組成的GJ是相鄰SGC及與其神經(jīng)元偶聯(lián)的主要方式。

2縫隙連接在外周神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的作用

2.1縫隙連接在施萬細(xì)胞中的作用

SCs縫隙連接在周圍神經(jīng)損傷、再生與修復(fù)中起關(guān)鍵作用。外周神經(jīng)損傷后SCs被激活，刺激軸突生長及神經(jīng)營養(yǎng)因子和轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)。同時，激活的SCs產(chǎn)生膠原蛋白、層粘連蛋白、細(xì)胞粘著分子及表達(dá)受體，如IL-1、N-鈣粘蛋白、γ整聯(lián)蛋白以及神經(jīng)細(xì)胞粘附分子（N-CAM）等，參與損傷應(yīng)答與修復(fù)。此外，SCs通過縫隙連接調(diào)控離子流（Na+，K+），參與機(jī)體生理調(diào)控過程。

Cx29在NCC分化成SCPs的過程中開始表達(dá)。Cx29缺陷的小鼠并沒有表現(xiàn)出SCs紊亂。在SCs中，對Cx29亞結(jié)構(gòu)定位結(jié)果表明，其在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞相互作用中具潛在作用。有證據(jù)表明，Cx29并不形成縫隙連接功能，但其在SCs發(fā)育過程中很重要。Cx29 mRNA在外周神經(jīng)中的含量非常豐富，Li等利用Cx29抗體研究也確定了Cx29在坐骨神經(jīng)中的表達(dá)和定位。轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞中存在Cx29，RT-PCR和免疫組化分析，提示了Cx29的半通道功能。Altevogt等研究發(fā)現(xiàn)Cx29與軸突膜附近的Kvl.2 K+通道偶聯(lián)，表明Cx29半通道參與髓鞘軸漿K+轉(zhuǎn)運。因此，Cx29具半通道活性，它直接參與髓鞘軸漿K+轉(zhuǎn)運，軸突信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及SCs增殖分化。

Cx32蛋白是由GJBl/Gjb1基因編碼的，目前至少發(fā)現(xiàn)400種Cx32突變體，SCs上Cx32突變導(dǎo)致遺傳性周圍神經(jīng)運動和感覺病變綜合癥-X-連鎖腓骨肌萎縮癥（X-linked charcot-marie-toothdisease，CMTIX）。Cx32突變致使通道功能缺陷，特別是阻止了第二信使分子的擴(kuò)散，從而使相鄰細(xì)胞功能紊亂。N-端突變導(dǎo)致Cx32生物物理特性改變和門控極性反轉(zhuǎn)，突變半通道兩個胞內(nèi)環(huán)上半胱氨酸殘基導(dǎo)致通道功能缺失，而突變胞內(nèi)環(huán)和C-端區(qū)域則影響pH門控。轉(zhuǎn)基因小鼠中突變SCs Cx32基因位點R75W和T551，不能形成Cx32縫隙連接通道功能，但不會影響其他縫隙連接蛋白的表達(dá)（如Cx29）。此外，突變Cx32也會增加非結(jié)合膜表面半通道的開放，降低離子梯度和小的代謝物，增加Ca2+的涌入，對細(xì)胞造成損害。因此，Cx32在縫隙連接通道物理特性、門控特性、通道特性以及Ca2+信號等功能調(diào)控中具重要作用。

2.2縫隙連接在衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞中的作用

縫隙連接在神經(jīng)痛和炎性痛中扮演重要角色，研究表明SGCs通過縫隙連接調(diào)控離子濃度和神經(jīng)興奮性。神經(jīng)元與SCCs間的縫隙連接促進(jìn)非突觸化學(xué)遞質(zhì)擴(kuò)散。Ohara等已證明SGCs間是通過縫隙連接偶聯(lián)，調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞周圍環(huán)境從而維持神經(jīng)元的穩(wěn)態(tài)。膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic prolein，GFAP）表達(dá)的增加和細(xì)胞增殖被用來指示SCCs神經(jīng)損傷應(yīng)答。因此，可以用GFAP及連接蛋白來標(biāo)記傷害刺激下縫隙連接通道的表達(dá)變化，進(jìn)而為闡明其參與疼痛調(diào)控機(jī)制提供證據(jù)。

外周損傷引起SGCs顯著改變，Pannese等（2003）切斷小鼠坐骨神經(jīng)導(dǎo)致DRG上SCCs間偶聯(lián)增加，且電鏡證據(jù)表明這種增加與縫隙連接增加密切相關(guān)。神經(jīng)損傷活化SGCs，使SGCs間通過縫隙連接偶聯(lián)，膠質(zhì)細(xì)胞偶聯(lián)對胞外高K+起緩沖作用，產(chǎn)生異常神經(jīng)活性和慢性痛。神經(jīng)損傷使得動作電位增加，從而介導(dǎo)神經(jīng)元釋放ATP以及激活神經(jīng)元周罔SGCs上P2受體，胞質(zhì)Ca2+增加，產(chǎn)生疼痛。高K+使得SGCs間以及SGCs與神經(jīng)元間去極化，從而使Ca2+流人，神經(jīng)元釋放化學(xué)信號，改變胞間偶聯(lián)。SGCs中的縫隙連接蛋白缺陷致使細(xì)胞功能紊亂；采用RNAi技術(shù)沉默正常大鼠中Cx43表達(dá)致使胞外K+增加，K+平衡被打破，引致痛敏增加；進(jìn)而，在神經(jīng)損傷大鼠中沉默Cx43，使得谷氨酸循環(huán)途徑中斷，可起鎮(zhèn)痛作用。神經(jīng)損傷后，SGCs中的縫隙連接大量增加來應(yīng)對ATP和谷氨酸的增加。此外，降低正常動物Cx43的表達(dá)導(dǎo)致白發(fā)痛和誘發(fā)痛行為。這些結(jié)果表明，SGCs的Cx43縫隙連接通道在疼痛調(diào)控中具有重要作用。

3連接蛋白磷酸化在外周神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的功能調(diào)控

縫隙連接通道受膜電樂、pH、連接蛋白磷酸化等的調(diào)控。連接蛋白磷酸化有助于縫隙連接通道的選擇性，驅(qū)動縫隙連接通道內(nèi)化和降解，從而使通道激活或失活。不同連接蛋白磷酸化作用不同，大多連接蛋白磷酸化位點位于C-端，極少數(shù)位于胞質(zhì)環(huán)，而N—端幾乎沒有。

3.1Cx43磷酸化

Cx43磷酸化是由多種蛋白激酶介導(dǎo)的動態(tài)過程。12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯（12一O一tetradecanoylphorbol -13-acetate，TPA）重疊致使Cx43絲氨酸磷酸化從而介導(dǎo)縫隙連接下調(diào)和改變Cx43 SDS-PAGE遷移率。激活PKC增加Cx43磷酸化，降低縫隙連接通訊，不同蛋白激酶作用Cx43磷酸化位點不同，MAPK磷酸化Cx43 C一端絲氨酸255、279和282位，PKC磷酸化Cx43 C一端絲氨酸368和372位，p34cdc2磷酸化Cx43 C一端絲氨酸262位，CK1磷酸化Cx43 C一端絲氨酸325、328和330位，PKA磷酸化Cx43 C一端絲氨酸364、365、369和373位，v-Src磷酸化Cx43 C一端酪氨酸247和265位。且不同磷酸化位點扮演的角色不同，C-端酪氨酸247位或265位磷酸化降低縫隙連接通訊和Cx43的定位，絲氨酸325、328和330位磷酸化調(diào)控縫隙連接組裝。研究表明，連接蛋白磷酸化調(diào)控細(xì)胞周期縫隙連接通訊，如PKC激活介導(dǎo)的Cx43磷酸化降低G0期到S期縫隙連接通訊，p34cdc2介導(dǎo)的Cx43磷酸化下調(diào)G2/M期縫隙連接通訊，S期和G2/M期磷酸化Cx43絲氨酸368位降低縫隙連接組裝。胰腺癌細(xì)胞中Cx43絲氨酸279和282位的磷酸化能調(diào)節(jié)其內(nèi)吞作用和縫隙連接組裝。MAPK多重磷酸化Cx43，致使壁顆粒細(xì)胞之間的縫隙連接通道關(guān)閉和內(nèi)化。

以上證據(jù)表明，Cx43具多重磷酸化位點，不同位點磷酸化在縫隙連接通道合成、組裝、內(nèi)化以及調(diào)控等生理過程中具重要作用，且涉及眾多生理病理過程，但其參與調(diào)控機(jī)制仍不明了。因此，體內(nèi)Cx磷酸化對胞間信號分子調(diào)控蘊含巨大研究空間。

3.2其他Cx磷酸化

Cx具多重磷酸化位點，由不同蛋白激酶激活，調(diào)控GJ通訊。不同蛋白激酶激活的Cx氨基酸磷酸化位點也各有不同，PKA/PKC激活Cx32絲氨酸233位，內(nèi)皮生長因子受體激酶激活Cx32酪氨酸殘基。增加胞內(nèi)cAMP水平或胞內(nèi)注射PKC激活劑均提高Cx32磷酸化水平，影響CJ特性，激活胞內(nèi)PKA將瞬間增加Cx32通道電導(dǎo)，阻止其被鈣蛋白酶水解，調(diào)控通道活性。

現(xiàn)已證明Cx46 C-端絲氨酸殘基118位和493位可被磷酸化，激活胞內(nèi)PKC可磷酸化Cx46絲氨酸118位，降低了PKCy依賴通訊。目前關(guān)于Cx46磷酸化的研究主要集中于視覺晶狀體，Cx32缺失則致使X-連鎖腓骨肌萎縮癥，而在神經(jīng)系統(tǒng)中調(diào)控作用研究的很少，有關(guān)Cx29磷酸化問題的報道幾乎沒有。盡管已明確縫隙連接參與疼痛信號通路，其機(jī)理卻不明了。因此，進(jìn)一步探明Cx磷酸化及其功能調(diào)控作用，仍將是縫隙連接通道研究的主要內(nèi)容。

4結(jié)語

SCs和SGC是兩種重要的外周神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，縫隙連接通道蛋白缺陷，將誘發(fā)疾病并影響疼痛反應(yīng)。隨著研究的不斷深入，相信外周神經(jīng)膠質(zhì)縫隙連接與疼痛的關(guān)系將越來越清楚，將有可能成為疼痛治療新靶點。目前研究Cx多以RT-PCR、Western-blot、免疫組化的方法，但僅有少量以磷酸化為靶點，探究Cx的表達(dá)特性及功能。而磷酸化在通道選擇性、極性方面至關(guān)重要，大多數(shù)連接蛋白家族成員中都存在潛在的磷酸化調(diào)控作用，但截止目前也僅Cx43磷酸化相對較為清楚，Cx其他亞型磷酸化的研究則較為滯后。此外，除磷酸化外，其他的調(diào)控方式也有待深入研究。因此，DRG與其他功能腦區(qū)中Cx生理病理功能調(diào)控機(jī)制的研究仍有巨大的方法學(xué)和生物學(xué)拓展空間。