蔣偉民 黃元華 馬燕琳

摘要：人胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cell，hESCs）是早期胚胎或原始性腺中分離出來的一類細(xì)胞，它具有無限增殖、自我更新和全能分化的特性。無論在體內(nèi)還是體外環(huán)境，人胚胎干細(xì)胞都能分化為機(jī)體幾乎所有類型的細(xì)胞基于其全能分化性，胚胎干細(xì)胞成為治療各種退行性疾病的理想細(xì)胞來源。然而，在目前培養(yǎng)條件下所建立的胚胎干細(xì)胞株，仍然存在動物源性物質(zhì)潛在污染的問題。因此，更優(yōu)化的建株及培養(yǎng)條件十分重要。

關(guān)鍵詞：人胚胎干細(xì)胞（hESC）；內(nèi)細(xì)胞團(tuán)；飼養(yǎng)層細(xì)胞；培養(yǎng)條件；mTESRl

中圖分類號：Q2-33

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1007-7847（2014）04-0349-04

人胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cell，hESCs）是從早期胚胎（原腸胚期之前）或原始性腺中分離出來的一類細(xì)胞，它具有無限增殖、自我更新和全能分化的特性，基于這些特性，胚胎干細(xì)胞可以被廣泛地利用于個體發(fā)育研究、藥物藥理、干細(xì)胞移植治療等多個領(lǐng)域。尤其是胚胎干細(xì)胞移植治療方面，被認(rèn)為是治療由于細(xì)胞退化及功能喪失所導(dǎo)致的多種退行性疾病的最有前景的治療手段。1998年美國Thomson實(shí)驗(yàn)室建立起第一株人胚胎干細(xì)胞，同年，SHAMBLOTT小組從人原生殖嵴細(xì)胞及腸系膜細(xì)胞中分離出多能干細(xì)胞，以后的十幾年中，雖然人胚胎干細(xì)胞的建株及維持培養(yǎng)條件不斷地改進(jìn)，但仍然沒有解決異源性物質(zhì)潛在污染的問題，最優(yōu)化的培養(yǎng)條件的建立對于干細(xì)胞研究的發(fā)展以及最終的臨床應(yīng)用都是極其重要的。在此，本文從不同方面總結(jié)了在人胚胎干細(xì)胞建株和維持培養(yǎng)條件上所取得的進(jìn)步。

1經(jīng)典的建株和維持培養(yǎng)方法與存在的問題

經(jīng)典的胚胎干細(xì)胞建株的方法是基于小鼠胚胎干細(xì)胞建株與維持培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上的，采用免疫外科學(xué)的方法，用Tyrode's液去除透明帶，用動物抗人抗體與囊胚的滋養(yǎng)層細(xì)胞結(jié)合，清洗并添加不含抗體的培養(yǎng)基，然后利用動物血清使滋養(yǎng)層細(xì)胞溶解，從而得到內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（inner cellmass，ICM），繼而將ICM轉(zhuǎn)移到以小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblast，MEF）或者永生的MEF（STO line）怍為飼養(yǎng)層細(xì)胞（feeder cell）的條件中培養(yǎng)，最終得到胚胎干細(xì)胞。建立起來的胚胎干細(xì)胞株具有以下幾個方面的特點(diǎn)：1）具有無限增殖的能力及自我更新、自我修復(fù)的能力，且在增殖過程中能夠保持核型的穩(wěn)定性；2）細(xì)胞表達(dá)全能性基因；3）無論在體內(nèi)還是在體外環(huán)境中，都能分化成為機(jī)體所有類型的細(xì)胞。自此后的許多年，人們一直延用這種建株及維持培養(yǎng)的方法，但是這種方法有其不可避免的弊端，傳統(tǒng)的培養(yǎng)辦法中采用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，同時(shí)在培養(yǎng)基中包含了一些動物源性的成分，這些外源性成分會對人胚胎干細(xì)胞造成潛在的污染，使其存在應(yīng)用的風(fēng)險(xiǎn)。

2建株的細(xì)胞來源及細(xì)胞分離方法的發(fā)展情況

2.1干細(xì)胞的來源

傳統(tǒng)的方法通過獲得ICM，繼續(xù)培養(yǎng)來建立胚胎干細(xì)胞株。有研究人員采用將已經(jīng)建成的人胚胎干細(xì)胞與體細(xì)胞融合以及利用孤雌生殖的方法來獲得囊胚，繼而從中獲得胚胎干細(xì)胞，這種方法所獲得的細(xì)胞，由于染色體數(shù)目上的異常，并不是理想的方法。人們也嘗試從桑葚期的胚胎和已經(jīng)停止發(fā)育的胚胎中獲得胚胎干細(xì)胞，但是由于建株成功率太低（1.5%），也不能成為有效的辦法。采用類似于植入前診斷（preimplantationgenetic diagnosis，PGD）的方法，Chung等通過顯微操作的手段，從處于8細(xì)胞期的胚胎中取出單卵裂球，與親輩胚胎共培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，以期使具體的個體可以有遺傳背景完全一致的全能干細(xì)胞，并成功建立起胚胎干細(xì)胞株。然而，沒有一個被取出單卵裂球的胚胎繼續(xù)發(fā)育成為一個完整的個體，使得這種方法不能被廣泛地應(yīng)用。有學(xué)者利用體細(xì)胞核移植（somatic cellnuclear transfer，SCNT）技術(shù)，將已經(jīng)建立起來的胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞核移植到卵細(xì)胞內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)至囊胚后從中分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)建株，但是，利用這種方法并沒有建立起胚胎干細(xì)胞株。為了獲得疾病特異性的多能干細(xì)胞，有學(xué)者通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染和基因重編程的方法，使得已經(jīng)是終末分化的體細(xì)胞重新具有干細(xì)胞的特性，這就是我們所熟悉的誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞（induced pluripotent stemcell，iPS）。這種方法建立起來的iPS株具有一定的優(yōu)勢，由于體細(xì)胞是取自接受移植治療患者本人，這就最大程度避免了異體移植有可能產(chǎn)生的移植排斥反應(yīng)，成為了獲得干細(xì)胞的另一重要來源。

2.2內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的分離方法

第一株人胚胎干細(xì)胞的分離過程中，使用了動物抗人抗體及動物血清等動物源性的成分，由于這些動物源性成分可能對人胚胎干細(xì)胞造成潛在的污染，使得用這種方法建立起來的人胚胎干細(xì)胞株在后期的應(yīng)用中存在風(fēng)險(xiǎn)。利用機(jī)械法直接分離囊胚的透明帶以及滋養(yǎng)層細(xì)胞來獲取ICM或用酶消化的方法去除透明帶從而分離ICM，在一定程度上避免了ICM與動物源性成分的直接接觸，從未來的使用方面來說是比較理想的分離1CM的辦法。此外，通過利用激光束在透明帶上打孔，在顯微鏡下，利用固定針固定囊胚，用活檢針將囊胚從透明帶中取出，之后，直接將取出的囊胚在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，或再利用激光束將ICM與滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)一步分離，再在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，這種方法也是一種可行的方法。也有學(xué)者采用將單卵裂球與已經(jīng)建成的干細(xì)胞共培養(yǎng)的方法來獲得胚胎干細(xì)胞，但這種方法建株的效率不高。

3飼養(yǎng)層細(xì)胞的發(fā)展與無飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)條件

3.1飼養(yǎng)層細(xì)胞

傳統(tǒng)的方法使用MEF作為飼養(yǎng)層細(xì)胞來維持胚胎干細(xì)胞的生長，但是由于潛在污染的問題，MEF并不是最理想的滋養(yǎng)層細(xì)胞。有研究者指出，MEF能夠?yàn)榕咛ジ杉?xì)胞提供更多的增殖空間，而HFF（human foreskin fibroblast，HFF）分泌的生長因子能夠更好的促進(jìn)胚胎干細(xì)胞的生長，鑒于這個特點(diǎn)，以期能更好的支持胚胎干細(xì)胞的生長，人們使用小鼠成纖維細(xì)胞跟人包皮成纖維細(xì)胞按比例混合而成的混合飼養(yǎng)層細(xì)胞來培養(yǎng)hESC，相對利用單一的飼養(yǎng)層細(xì)胞相比較來說，生長在單一的飼養(yǎng)層細(xì)胞上的人胚胎干細(xì)胞克隆扁平、較薄，而生長在混合飼養(yǎng)層上的人胚胎干細(xì)胞克隆飽滿、厚實(shí)，其克隆形態(tài)顯著好于單一飼養(yǎng)層，但是這種方法并沒有避免異源性物質(zhì)的污染問題。為了找尋非動物源性的飼養(yǎng)層細(xì)胞，人們采用了處于不同發(fā)育階段的不同組織來源的人體細(xì)胞作為MEF的替代品，如：人類包皮成纖維細(xì)胞、胎盤細(xì)胞、子宮內(nèi)膜細(xì)胞、成人骨髓基質(zhì)細(xì)胞、胎兒肌肉細(xì)胞、胎兒皮膚細(xì)胞。盡管不同的細(xì)胞取得的效果不同，但都能使干細(xì)胞保持未分化的狀態(tài)。此外，胚胎干細(xì)胞自身分化所形成的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞也能成為一個自體的飼養(yǎng)層細(xì)胞來源。由此得到的飼養(yǎng)層細(xì)胞，具有特異性，避免了動物源性成分或異源性成分對于胚胎干細(xì)胞的污染。

3.2無飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)條件

為了進(jìn)一步純化胚胎干細(xì)胞以減少日后使用的風(fēng)險(xiǎn)，有學(xué)者提出是否能夠采用成分明確的物質(zhì)的組合來徹底替代飼養(yǎng)層細(xì)胞的粘附功能及分泌功能，為了解決這個問題，van Hoof等利用基底膜基質(zhì)（Matrigel）和纖連蛋白（fibronectin）來代替飼養(yǎng)層細(xì)胞的功能，同時(shí)，利用飼養(yǎng)層細(xì)胞條件培養(yǎng)基（feeder conditioned media）跟成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor）維持干細(xì)胞的未分化狀態(tài)，這種方法取得了不錯的效果。事實(shí)上，這種無飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)條件能夠很好地維持胚胎干細(xì)胞的生長及未分化狀態(tài)，許多實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)在都采用這種條件培養(yǎng)胚胎于細(xì)胞。

3.3胚胎干細(xì)胞的體外培養(yǎng)液體系

為了避免培養(yǎng)液中所含成分對胚胎干細(xì)胞的潛在污染，人們從不同方而做出了努力。首先，在飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)基方面，人們用成分確定的培養(yǎng)基、細(xì)胞因子以及人血清培養(yǎng)人成纖維細(xì)胞，得到了不含任何動物源性以及不確定成分的飼養(yǎng)層細(xì)胞株。這種方法既保留了飼養(yǎng)層細(xì)胞在胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)過程中的作用，又避免了動物源性成分對胚胎干細(xì)胞的污染。胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)基方面，傳統(tǒng)的培養(yǎng)基中含有FBS （fetal bovineserum），其中包含有動物源性的蛋白以及一些成分不確定的物質(zhì)，使得所建的干細(xì)胞株可能被污染。為了解決這一問題，Richards等用人血清替代FBS進(jìn)行胚胎干細(xì)胞的維持，以期能夠避免動物源性成分對胚胎干細(xì)胞的潛在污染。但是，由于人血清中也含有許多復(fù)雜的、成分不明確的物質(zhì)，而且有可能包含有一些誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化的物質(zhì)，所以也沒有很好地解決問題。后來的學(xué)者利用成分更加確定的血清替代品（knockout serumreplacement，KSR）來代替FBS。有趣的是，與含有FBS的培養(yǎng)基相比，在KSR培養(yǎng)基中胚胎干細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的增殖能力，但是，血清替代品仍然包含有動物蛋白，而且并不是成分完全確定的，所以也不是最理想的。此外專為培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基mTESRl能很好的維持人胚胎干細(xì)胞的生長，但是，這種培養(yǎng)基仍然包含有少部分動物源性成分。成分確定的培養(yǎng)基是至關(guān)重要的。學(xué)者們希望通過采用一些已知成分的組合來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的培養(yǎng)基，這樣既維持了胚胎干細(xì)胞的生長，也不會造成潛在的污染。一些研究組織報(bào)道了在培養(yǎng)基中成功使用各種不同組分能夠成功地維持胚胎干細(xì)胞未分化狀態(tài)的例子，如：bFGF和透明質(zhì)酸（hyaluronic acid），轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）、bFGF和白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF），bFGF和GSK3抑制劑（GSK3 inhibitor），激活素A （activin A）和bFGF等。Wang、Xu等發(fā)現(xiàn)，利用BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路拮抗劑（BMP sig—naling antagonist Noggin）和高濃度的bFGF就可以維持胚胎干細(xì)胞處于未分化狀態(tài)。Beattie等發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中使用激活素A、煙酰胺（nicoti-namide，NIC）和角化細(xì)胞生長因子（keratinoCytegrowth factor，KGF）能夠維持細(xì)胞的末分化狀態(tài)，并認(rèn)為激活素A能夠阻斷干細(xì)胞的分化，煙酰胺和角化細(xì)胞生長因子則在細(xì)胞增殖方面起作用。通過這些方法，將成分明確的物質(zhì)組合起來，就使得培養(yǎng)基的組成更為簡單，成分更為確定。近來，建立起第一株人類干細(xì)胞的Thomson實(shí)驗(yàn)室的學(xué)者們，為了使得培養(yǎng)出來的hESCs和iPS能夠更接近于臨床使用的目標(biāo)，利用8種成分已經(jīng)確定的成分組成胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)基（E8），在實(shí)際的應(yīng)用過程中，這些成分確定而又簡單的培養(yǎng)基在維持胚胎干細(xì)胞及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的未分化狀態(tài)以及細(xì)胞增殖方面也取得了不錯的效果。

4臨床級別的人胚胎干細(xì)胞

人們期望利用胚胎干細(xì)胞的特性來治療各種退行性疾病，這就要求我們所建立的人胚胎干細(xì)胞株必須是臨床級別的細(xì)胞。如何獲得臨床級別的人胚胎干細(xì)胞是一個難題，目前人們大多使用GMP（good manufacturing practices，GMP）的標(biāo)準(zhǔn)來確保所獲得的人胚胎干細(xì)胞的質(zhì)量以及判斷其是否為臨床級別的細(xì)胞。GMP要求從人胚胎干細(xì)胞建株過程中的各個環(huán)節(jié)都有質(zhì)量保證。首先，實(shí)驗(yàn)過程中所使用的耗材及試劑必須經(jīng)過GMP認(rèn)證，實(shí)驗(yàn)平臺需通過GLP（good laboratorypractice，GLP）質(zhì)量認(rèn)證，實(shí)驗(yàn)中所使用的飼養(yǎng)層細(xì)胞必須是在符合GLP的實(shí)驗(yàn)平臺上采用符合GMP標(biāo)準(zhǔn)的試劑與耗材建立起來的細(xì)胞株，飼養(yǎng)層細(xì)胞必須符合GMP標(biāo)準(zhǔn)或獲得FDA（food anddrug administration，F(xiàn)DA）認(rèn)證。同時(shí)，胚胎干細(xì)胞的操作必須有標(biāo)準(zhǔn)的操作程序，實(shí)驗(yàn)人員的培訓(xùn)必須符合GMP的標(biāo)準(zhǔn)，所獲得的人胚胎干細(xì)胞需經(jīng)過QC（quality certification，QC）的檢測及生物安全性檢測?，F(xiàn)有的胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)液體系，由于其未避免異源性基因的插入，或由于其體系中含有成分不確定的組分而可能對胚胎干細(xì)胞造成潛在污染的風(fēng)險(xiǎn)，都不能完全符合臨床使用的要求。只有符合GMP標(biāo)準(zhǔn)的臨床級細(xì)胞，使用到臨床時(shí)，才能確保細(xì)胞的安全性。尋找更加優(yōu)化、成分更加確定的、不含有動物源性成分的培養(yǎng)條件顯得尤為重要。雖然現(xiàn)存的各種培養(yǎng)液體系經(jīng)過全球科學(xué)家多年的不斷悉心探索，已經(jīng)取得了長足的進(jìn)步，但是由于培養(yǎng)液體系中的種種缺陷，使得在這些條件下建立起來的人胚胎干細(xì)胞仍然不能完全符合臨床使用的要求，在尋求最優(yōu)化的培養(yǎng)液體系的道路上，我們?nèi)匀蝗沃氐肋h(yuǎn)。

5結(jié)論與展望

在過去的十幾年中，胚胎干細(xì)胞事業(yè)以迅猛的勢頭不斷地向前發(fā)展，迅速成為當(dāng)今最熱門的研究內(nèi)容。由于其獨(dú)有的特性，胚胎干細(xì)胞以后的應(yīng)用也具有廣闊的前景。盡管從第一株胚胎干細(xì)胞建立成功以來，胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)體系的各個方面都不斷地得到升級跟優(yōu)化，但是，由于后期應(yīng)用于臨床移植治療的需求，目前所建立起來的胚胎干細(xì)胞系因?yàn)楦鞣N原因仍然不適合在臨床應(yīng)用。除此之外，目前各種培養(yǎng)體系也并不是最優(yōu)化的。如何提高胚胎干細(xì)胞的建株成功率、如何改變培養(yǎng)基的成分使其真正成為最優(yōu)化、如何使得建立起來的胚胎干細(xì)胞株符合GMP標(biāo)準(zhǔn)而最終能適合于臨床應(yīng)用、目前建立起來的胚胎干細(xì)胞是否真正具有全能性等一系列問題仍然有待解決，只有在真正解決了這些問題之后，胚胎干細(xì)胞才能真正發(fā)揮其最大的潛力而最終造福于人類。