劉宴村 李輝 張艷 竇爽 張波 宋有濤

摘要：為研究石斛醇提取物的抗朊病毒作用，借助酵母朊病毒[PSI+]表型系統(tǒng)分析石斛醇提取物對(duì)酵母朊病毒[PSI+]表型的作用，引入半變性瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)在蛋白質(zhì)水平分析石斛醇提取物對(duì)酵母朊病毒的治療效果結(jié)果顯示，石斛醇提取物濃度在15g/L時(shí)，作用酵母朊病毒[PSI+]細(xì)胞5d的治愈率為5%；并且石斛醇提取物濃度在5～20g/L范圍內(nèi)時(shí)，藥物劑量與酵母朊病毒[PSI+]表型治療效果呈現(xiàn)較好正相關(guān)性。蛋白水平試驗(yàn)表明石斛醇提取物作用酵母朊病毒[PSI+]細(xì)胞5d后紅色菌落的朊病毒聚集體大小與[psi-]相似。

關(guān)鍵詞：石斛醇提取物；酵母朊病毒；[PSI+]；治愈

中圖分類號(hào)：S859.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-7847（2014）04-0344-05

朊病毒是一類能在人和哺乳動(dòng)物中引起可傳染性海綿狀組織腦?。╰ransmissible spongiformencephalopathies，TSEs）的病原體，由于其致病機(jī)理的復(fù)雜性，迄今為止對(duì)于朊病毒疾病仍缺乏有效的治療藥物。我國(guó)的中醫(yī)、中藥學(xué)對(duì)于阿爾茨海默癥和帕金森病等與朊病毒疾病發(fā)病機(jī)理相似的疾病的治療有悠久的歷史，而且有研究顯示在綠茶和姜黃提取物中存在具有抗朊病毒活性的成分，暗示著中藥在篩選抗朊病毒藥物中的巨大潛力。

近年來，抗朊病毒藥物篩選模型是國(guó)際上篩選抗朊病毒候選藥物的熱點(diǎn)；由于動(dòng)物朊病毒細(xì)胞模型不具備明顯的細(xì)胞表型；并且存在著與哺乳類動(dòng)物內(nèi)朊病毒交叉?zhèn)魅镜奈ｋU(xiǎn)性，使得實(shí)驗(yàn)成本昂貴、操作繁雜，嚴(yán)重限制了該領(lǐng)域的研究進(jìn)展；而酵母朊病毒[PSI+]具有易于檢測(cè)的遺傳表型及其與動(dòng)物具有嚴(yán)格種間屏障的優(yōu)勢(shì)，因此基于酵母細(xì)胞的抗朊病毒候選藥物篩選模型在大規(guī)模篩選上具有經(jīng)濟(jì)、安全和易實(shí)現(xiàn)高通量篩選等特性，而越來越受到關(guān)注；而且利用酵母模型Bach等從近4000種小分子化合物中篩選發(fā)現(xiàn)了11種可以治愈酵母朊病毒細(xì)胞的化合物，并且證實(shí)KP16-氨基菲啶和胍那芐等3種化合物能夠在動(dòng)物細(xì)胞模型中清除聚集狀態(tài)的哺乳動(dòng)物朊病毒。本研究借助酵母朊病毒[PSI+]模型并結(jié)合表型實(shí)驗(yàn)和半變性瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)（semi-denaturing detergent-agarose gel electroph-oresis，SDD-AGE），研究石斛醇提物對(duì)酵母朊病毒[PSI+]的治愈作用。

l材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種

釀酒酵母（Saccharomyce.s cerevisiae）： MA Takar1 SUQ5 ade2-1 his3△202leu2△l trp1△63 ura3-52 erg6：：KanMX，[PSI+]。

1.1.2培養(yǎng)基

1/2YPD液體培養(yǎng)基：0.5%酵母浸出粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖，葡萄糖單獨(dú)滅菌。

1/2YPD固體培養(yǎng)基：0.5%酵母浸出粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖、2%瓊脂粉，pH天然，葡萄糖單獨(dú)滅菌。

YPAD固體培養(yǎng)基：1%酵母浸出粉、2%蛋白胨、0.04%腺嘌呤、2%葡萄糖、2%瓊脂粉，葡萄糖單獨(dú)滅菌。

SD-Ade固體培養(yǎng)基：0.7% YNB-AA、2%葡萄糖、2%瓊脂粉，pH天然，葡萄糖單獨(dú)滅菌。倒平板前加入氨基酸His、Ura、Trp、Leu分別為20、20、20、60mg/L。

1.1.3主要試劑和儀器

石斛購于遼寧省沈陽市國(guó)大藥房；腺嘌呤、尿嘧啶、色氨酸等購于北京市鼎國(guó)技術(shù)有限公司：羊抗Sup35抗體與HRP標(biāo)記的驢抗羊IgG購于圣克魯斯生物技術(shù)公司（美國(guó)）；瓊脂糖水平電泳槽（DYC0-31DN，北京六一公司）；轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司，美國(guó)）；珠磨破碎儀（Bio spec公司，美國(guó)）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE52CS-2，上海亞榮生化儀器廠）。

1.2方法

1.2.1石斛醇提取物的制備

稱石斛粉末10g，加入8倍體積的80%乙醇回流提取3次，每次3h，合并3次的提取液，60℃減壓蒸發(fā)，濃縮至50mL，然后烘干至恒重，用5% DMSO（二甲基亞楓）溶解成200g/L的提取液備用。

1.2.2石斛醇提取物對(duì)酵母朊病毒[PSI+]治愈作用的研究

[PSI+]酵母細(xì)胞在24℃過夜活化培養(yǎng)后，調(diào)整菌液光密度OD600為0.2左右，按10%接種量分別接種到含有不同濃度石斛醇提取物的1/2 YPD液體培養(yǎng)基中，所有體系于24℃振蕩培養(yǎng)5d，每隔24h更換培養(yǎng)基和石斛醇提取物；分別在1、3、5d取培養(yǎng)液稀釋后涂布于1/2 YPD固體平板，平板于24℃恒溫培養(yǎng)7d，觀察菌落顏色變化，統(tǒng)計(jì)陽性菌落的比例[15]。

1.2.3石斛水提取物的制備及對(duì)酵母朊病毒[PSI+]作用的研究

稱石斛粉末10g，加入100mL蒸餾水回流提取3h，用濾液配制1/2 YPD液體培養(yǎng)基，滅菌后備用。[PSI+]酵母細(xì)胞在24℃過夜活化后，到菌液光密度OD600為0.2左右時(shí)，按10%接種量接種到含有石斛水提取物的1/2 YPD液體培養(yǎng)基內(nèi)，并于24℃培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)基；5d后稀釋培養(yǎng)液并涂布于1/2 YPD固體平板，平板于24℃培養(yǎng)，觀察菌落顏色變化。

1.2.4遺傳表型實(shí)驗(yàn)分析石斛醇提取物對(duì)酵母朊病毒[PSI+]的治療效果

采用表型分析法分析中藥作用酵母朊病毒后的假陽性與假陰性結(jié)果；隨機(jī)挑取石斛醇提取物治愈酵母朊病毒[PSI+]后的紅色菌落劃線于1/2YPD平板上，分別影印到SD-Ade、1/2 YPD和YPAD固體平板上，24℃培養(yǎng)5d后記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.5半變性瓊脂糖凝膠電泳結(jié)合蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)分析石斛醇提取物對(duì)酵母朊病毒[PSI+]的治療效果

挑取石斛醇提取物治愈酵母朊病毒后的紅色菌落活化，接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)約16h，到菌液OD600=1.5左右時(shí)停止培養(yǎng)，離心收集細(xì)胞，加入裂解緩沖液，用珠磨儀裂解細(xì)胞，離心收集上清得到蛋白樣品；然后采用SDD-AGE/Western blot，首先進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后用在0℃、恒流0.35A條件下轉(zhuǎn)膜1h，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，羊抗Sup35抗體孵育lh，4℃過夜，HRP標(biāo)記的驢抗羊IgG孵育lh后，洗膜，采用ECL發(fā)光試劑盒對(duì)其進(jìn)行放射自顯影檢測(cè)，獲得圖像信息。

2結(jié)果與分析

2.1石斛醇提取物和水提取物對(duì)酵母朊病毒[PSI+]治愈作用的研究

釀酒酵母的ade2-1等位基因在ADEl （或ADE2）營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記編碼基因的開放閱讀框（ORF）（該基因編碼酵母合成腺嘌呤途徑所必須的ade 1酶）起始處有一個(gè)乳白終止密碼子。在[PSI+]細(xì)胞中，Sup35p聚集形成淀粉樣蛋白，導(dǎo)致無義突變抑制，產(chǎn)生終止密碼子通讀現(xiàn)象，合成腺嘌呤，使[PSI+]細(xì)胞在缺乏腺嘌呤的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)為白色菌落：在[psi-]細(xì)胞中，其Sup35p主要以單體形式存在，非無義抑制的ade2-1突變株需要在含有腺嘌呤的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，由于累積腺嘌呤合成途徑中的副產(chǎn)物，細(xì)胞因而形成紅色菌落如圖1 （注：因?yàn)槭呛诎子∷?，所以在本文的圖中根據(jù)紅色深淺顯示為深灰色或黑色），這個(gè)顏色指示系統(tǒng)可用來初步分析酵母朊病毒的存在狀態(tài)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，石斛水提取物作用酵母朊病毒5d后，無紅色菌落出現(xiàn)，石斛水提取物不能治愈酵母朊病毒所以研究5、10、15、20g/L石斛醇提取物對(duì)酵母朊病毒[PSI+]表型的治療作用，如圖2所示石斛醇提取物濃度為15g/L時(shí)，對(duì)酵母朊病毒[PSI+]具有明顯的治愈效果，治愈率為5%，但是當(dāng)石斛醇提取物濃度為20g/L時(shí)，出現(xiàn)抑菌性。

2.2遺傳表型實(shí)驗(yàn)分析石斛醇提取物對(duì)酵母朊病毒[PSI+]的治療效果

為了進(jìn)一步驗(yàn)證15g/L的石斛醇提取物表型上的治愈效果是否是假陽性，隨機(jī)選取15g/L的石斛醇提取物治愈的酵母朊病毒平板上出現(xiàn)的紅色菌落劃線于1/2 YPD同體平板上，分別影印到Y(jié)PAD、SD-Ade和另一個(gè)1/2 YPD平板上。由圖3可以看出，被石斛醇提取物治愈的酵母細(xì)胞在1/2 YPD培養(yǎng)基上為紅色，在YPAD為白色菌落，而在缺乏Ade的培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)（由于黑白印刷，所以在本文中紅色為深灰色，白色還是白色）。因此，在表型水平上的結(jié)果表明15g/L的石斛醇提取物對(duì)酵母朊病毒有一定的治愈效果。

2.3半變性瓊脂糖凝膠電泳結(jié)合蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)分析石斛醇提取物對(duì)酵母朊病毒[PSI+]的治療效果

在酵母朊病毒中，ADE1或ADE2的突變都會(huì)導(dǎo)致中間產(chǎn)物AIR的聚集，從而導(dǎo)致紅色素的聚集。而在這個(gè)合成途徑的較早步驟如果發(fā)生突變的話，例如ADE4、ADL5、ADE8、ADE6或者ADE7，就會(huì)在AIR合成之前阻斷該途徑并且阻止紅色素的聚集，從而無論朊病毒的狀態(tài)如何都會(huì)出現(xiàn)白色菌落。因此基于表型判定朊病毒狀態(tài)的方法雖然直觀，并且大部分時(shí)候是準(zhǔn)確的，仍然不能排除假陽性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的出現(xiàn)。所以，需進(jìn)一步在蛋白水平上研究石斛醇提取物對(duì)酵母朊病毒的治愈效果。

聚集體的相對(duì)分子質(zhì)量大小是反應(yīng)酵母朊病毒聚集程度的重要指標(biāo)，而SDS-PAGE/Westernblot技術(shù)僅能分析朊病毒是否發(fā)生聚集，近年來發(fā)展的半變性瓊脂糖凝膠電泳（SDD-AGE）結(jié)合Western blot技術(shù)能夠精確檢測(cè)朊病毒聚集體大小。所以本研究采用SDD-AGE/Western blot比較了不同表型菌落Sup35p蛋白的聚集狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分析了石斛醇提取物15g/L作用5d后出現(xiàn)的紅色菌落朊蛋白聚集體大小。如圖4所示對(duì)照的[PSI+]細(xì)胞朊病毒Sup35p蛋白主要以聚集體形式存在，而在[psi-]細(xì)胞中，Sup35p主要以單體形式存在。石斛醇提取物15g/L培養(yǎng)條件下治愈酵母朊病毒后其紅色菌落為可溶的單體形式，說明石斛醇提取物作用后的紅色菌落已被治愈。

3討論

借助本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建獨(dú)有的抗酵母朊病毒藥物篩物篩選平臺(tái)，采用酵母朊病毒[PSI+]表型和半變性瓊脂糖凝膠電泳結(jié)合免疫印跡技術(shù)分析了石斛醇提取物抗朊病毒作用；研究結(jié)果表明，石斛水提取物不能治愈酵母朊病毒[PSI+]，而石斛醇提取物對(duì)酵母朊病毒[PSI+]具有明顯的治療效果，表明石斛中含有能夠治療酵母朊病毒的成分，而且它存在于醇提取物中。石斛屬是蘭科中最大的一個(gè)屬，是一種傳統(tǒng)中草藥具有驅(qū)解虛熱、益精強(qiáng)陰的作用，現(xiàn)代藥理研究表明石斛還有抗衰老、提高免疫力和抗腫瘤等作用。石斛中的有效成分為生物堿類、酚類、多糖類、苯類極其衍生物等。有文獻(xiàn)表明石杉中的生物堿石杉?jí)A甲是一種可逆的膽堿酯酶抑制劑，對(duì)乙酰膽堿酯酶有較強(qiáng)的抑制作用，是一種可用于治療阿爾茨海默病的藥物，石斛中同樣含有生物堿，所以推測(cè)石斛中的生物堿類有治療酵母朊病毒的作用，但是這需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。近幾年來無論從中藥有效成分的提取到天然藥物的開發(fā)都得到了很大的進(jìn)展，中藥以其毒副作用小，療效確切占據(jù)獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，相繼發(fā)現(xiàn)了何首烏、人參皂苷、積雪草酸、銀杏、兩面針等極具前景的抗阿爾茨海默病活性成分。本文研究顯示了傳統(tǒng)中藥石斛的醇提物具有良好的治療酵母朊病毒活性，表明在中藥領(lǐng)域存在具有抗朊病毒活性的物質(zhì)，對(duì)于研究和開發(fā)抗哺乳動(dòng)物朊病毒的中藥制劑具有重要的意義，同時(shí)也有利于國(guó)際社會(huì)對(duì)中藥的認(rèn)同，加快中藥的國(guó)際化。