栗炳南 李衛(wèi)東 林俊堂 豐慧根 原志慶

摘要：構(gòu)建雙基因共表達(dá)載體pIRES2-NGF-NT-3并檢測其在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)。人神經(jīng)生長因子（nerve growth factor， NGF）和神經(jīng)營養(yǎng)素3（neurotrophin-3，NT-3）是采用直接PCR的方法從人外周血單個(gè)核細(xì)胞的基因組DNA中獲取，將人神經(jīng)生長因子的cDNA片段插入到pIRES2-EGFP多克隆位點(diǎn)構(gòu)建成為pIRES2-NGF-EGFP神經(jīng)營養(yǎng)素3cDNA片段通過替換綠色熒光蛋白基因（EGFP）的方式插入到pIRES2-NGF-EGFP中構(gòu)建成為pIRES2-NGF-NT-3雙基因共表達(dá)載體，將pIRES2-NGF-NT-3用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞并采用RT-PCR與Western-blot的方法檢測其表達(dá)。人神經(jīng)生長因子和神經(jīng)營養(yǎng)素3被克隆，通過測序和酶切鑒定的得知與基因庫報(bào)道序列一致。pIRES2-NGF-NT-3轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后雙基因在mRNA和蛋白水平均得到了表達(dá)。人神經(jīng)生長因子和神經(jīng)營養(yǎng)素3雙基因真核表達(dá)載體成功構(gòu)建，它提供了一個(gè)新的表達(dá)系統(tǒng)，為進(jìn)一步研究雙基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：人神經(jīng)生長因子；神經(jīng)營養(yǎng)素3；真核雙表達(dá)裁體；內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)

中圖分類號：Q812

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1007-7847（2014）04-0315-08

外傷性脊髓損傷發(fā)生率比較高，一般都會導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)損害。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的恢復(fù)是相當(dāng)困難的，因?yàn)槭軅闹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)，其細(xì)胞與髓鞘再生以及重建功能性神經(jīng)連接的能力有限。隨著干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，增加軸突再生的治療策略之一——干細(xì)胞向受損脊髓部位的移植研究越來越廣泛。

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）被認(rèn)為是一個(gè)很好來源的干細(xì)胞，由于巨大的自我更新和多譜系分化潛能。使用間充質(zhì)干細(xì)胞治療缺血性腦損傷的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，其療效已經(jīng)得到證實(shí)。人類骨髓細(xì)胞在治療血液病方面有著悠久的歷史。此外，非造血干細(xì)胞，如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs），卻可以分化成成熟的骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，骨髓細(xì)胞（骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞）在特定的實(shí)驗(yàn)條件下可以誘導(dǎo)分化為成熟的神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。這些發(fā)現(xiàn)為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于神經(jīng)性疾病患者的治療增加了可能性，這也避免了使用胚胎干細(xì)胞而帶來的倫理問題。

在組織工程研究中，采用基因修飾的方法來提高干細(xì)胞的增值和定向分化的能力一直是研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。神經(jīng)生長因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子或衍生的支架或在這些因素的基礎(chǔ)上構(gòu)建的表達(dá)載體在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中得到了廣泛的使用，并逐漸應(yīng)用于臨床研究。本研究旨在通過一種簡單和有效的方法構(gòu)建一個(gè)雙基因的真核表達(dá)載體pIRES2-NGF-NT-3，為進(jìn)一步研究NGF （nerve growth factor）與NT-3 （neu-rotrophin-3）這兩個(gè)基因的協(xié)同功能奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

pIRES2-EGFP購自北京天恩澤基因科技有限公司（中國）；人外周血單個(gè)核細(xì)胞取自健康捐獻(xiàn)者，已簽署知情同意書；E.coli菌株DH5α、HEK293T細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)室保存；T4 DNA連接酶、TaqDNA聚合酶、Xho I、BamH I、Not I、BstX I限制性內(nèi)切酶、總RNA的提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、高純度凝膠提取試劑盒、DNA marker均購自購自寶生物工程大連有限公司（中國）；Tri-zol Reagent和轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000購自Invitro-gen公司（美國）；DMEM培養(yǎng)基與新生牛血清、胰蛋白酶為購自Gibco公司（美國）；質(zhì)粒小提試劑盒購自Sangon公司（中國）；NGF與NT-3抗體一抗購Santa Cruz公司（美國）；引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成（中國）。

1.2引物的設(shè)計(jì)與合成

NGF（NM_002506.2）和NT-3（NM_0011026-54.1）在基因庫中的基因序列用來作為模板設(shè)計(jì)引物（見表1）。人神經(jīng)生長因子（NGF基因片段的核心編碼序列完全的基因組DNA的外顯子3上。兩條特異性的引物被設(shè)計(jì)用于從外顯子3上擴(kuò)增出人神經(jīng)生長因子。Xho I限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)和保護(hù)性堿基添加在上游引物，在下游引物中加入BamH I限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)和保護(hù)性堿基，擴(kuò)增片段長度為726bp。接著設(shè)計(jì)了兩對引物來擴(kuò)增人類神經(jīng)營養(yǎng)因子3。長的正向引物在5'末端比短的正向引物多出來4個(gè)堿基。與此類似，反向長引物序列比反向短引物序列也多出來4個(gè)堿基，我們通過雙PCR的方法在正向引物序列中引入了BstX I粘性末端一部分，而在反向引物序列中引入了Not I粘性末端一部分，這將用于組裝BstX I位和Not I粘性末端，擴(kuò)增片段長度為774bp。

1.3 pIRES2-NGF-EGFP表達(dá)載體的構(gòu)建

人外周血單核細(xì)胞的基因組DNA為模板，采用神經(jīng)生長因子特異性引物用于擴(kuò)增NGF基因。人神經(jīng)生長因子基因片段的核心編碼序列是完全位于基因組DNA的第3個(gè)外顯子上。采用20μL PCR反應(yīng)體系，包括基因組DNAO.5μL（10ng）， 2xPrimeSTARMaxDNAPolymerase 10μL，無RNase水7.5μL，上游引物和下游引物各1μL。反應(yīng)條件為：95℃ 5min，98℃ 10s，55℃，5s，72℃ 50s，30循環(huán)，最后，72℃，保持5min。用PCR純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物，然后將PCR產(chǎn)物和pIRES2-EGFP質(zhì)粒用Xho I和BamH I限制性內(nèi)切酶雙酶切。酶切后的PCR產(chǎn)物用PCR純化試劑盒純化。通過T4 DNA連接酶將該DNA片段插入到質(zhì)粒中。連接體系為20μL，包括質(zhì)粒pIRES2-EGFP 2μL，cDNA（神經(jīng)生長因子）8μL，T4 DNA連接酶0.2μL，其余添加滅菌水至20μL。在22℃水浴中連接30min。將連接后的片段轉(zhuǎn)化入DH5α中，然后平鋪入含有卡那抗性的LB培養(yǎng)板中37℃培養(yǎng)16h。第二天挑取陽性菌落進(jìn)行接種，在37℃、225r/min搖床中進(jìn)行培養(yǎng)12～16h，然后提取質(zhì)粒后酶切鑒定，即可得到重組pIRES2-NGF-EGFP質(zhì)粒。

1.4pIRES2/NGF-NT-3雙基因表達(dá)載體構(gòu)建

我們應(yīng)用一種簡單而有效的方法將未經(jīng)雙酶切的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物定向克隆入目的質(zhì)粒中。我們針對一個(gè)基因設(shè)計(jì)了兩對特異性的引物，該兩對引物均含有限制性內(nèi)切酶的部分序列，這兩對引物分別用來做孿生PCR。即首先產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物混合，經(jīng)熱變性和退火，以產(chǎn)生雜交的DNA片段，由此產(chǎn)生與特定內(nèi)切酶相對應(yīng)的粘性末端。這個(gè)方法在某些情況下是特別有用的，例如在克隆構(gòu)建時(shí)必須要用到一種限制酶，但不巧的是這種限制酶切位點(diǎn)正好位于要擴(kuò)增的序列內(nèi)部，或者當(dāng)PCR產(chǎn)物末端的限制性內(nèi)切酶的敏感性不高而引起的某些問題，都可以采用這種方法。

我們采用長正向引物/長反向引物或者短正向引物/短反向引物兩種引物對，以人的外周血單個(gè)核細(xì)胞基因組DNA為模板進(jìn)行孿生PCR反應(yīng)（圖1）。兩種反應(yīng)體系的反應(yīng)條件如下：94℃，30s；54℃，30s：72℃，1min，共30個(gè)循環(huán)，隨后由72℃，5min進(jìn)行延伸。PCR反應(yīng)采用的聚合酶為Prime STAR Max DNA Polymerase。預(yù)期的4種PCR產(chǎn)物采用DNA凝膠提取試劑盒量來進(jìn)行純化，并用分光光度計(jì)來進(jìn)行定量。

將質(zhì)粒pIRES2-NGF—EGFP經(jīng)BstX I與Not I雙酶切，然后進(jìn)行電泳后凝膠回收線性化載體片段，與此同時(shí)，將每一種類型的經(jīng)由高保真酶擴(kuò)增獲取的NT-3 PCR產(chǎn)物混合后，94℃熱變性4min，65℃退火2min。連接反應(yīng)如下：即將退火后形成的NT-3 PCR產(chǎn)物與線性化后pIRES2-NGF-EGFP（按照摩爾比為4：1）混合后在T4連接酶的作用下，16℃連接時(shí)間為3h。將連接產(chǎn)物經(jīng)由標(biāo)準(zhǔn)的氯化鈣轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化入DH5α，抗性篩選出重組體，培養(yǎng)擴(kuò)增后進(jìn)行質(zhì)粒的提取后雙酶切（BstX I與Not I）初步鑒定和DNA測序。

首先需要進(jìn)行兩個(gè)平行的PCR反應(yīng)，一個(gè)反應(yīng)采用的是長正向引物與長反向引物，另一個(gè)采用的是短正向引物與短反向引物。產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物即PCR產(chǎn)物A（I）與B（Ⅱ），兩者唯一不同的地方如圖所示在于PCR產(chǎn)物兩最末端的序列不同。接著將兩種PCR產(chǎn)物即等摩爾的PCR產(chǎn)物A（I）與B（Ⅱ）混合后經(jīng)熱變性與退火，兩種雙鏈DNA分子解鏈后隨機(jī)互補(bǔ)配對生成4種類型的PCR產(chǎn)物。其中PCR產(chǎn)物A（I）和B（Ⅱ）兩端為平端序列與原始序列相同，PCR產(chǎn)物Ⅲ和Ⅳ兩端為粘性末端序列，其中只有PCR產(chǎn)物Ⅲ兩末端含有正確的酶切位點(diǎn)序列即5'BstX I酶切序列和3'Not I酶切序列。PCR產(chǎn)物Ⅲ可以直接插入到經(jīng)BstX I和Not I。雙酶切線性化后的質(zhì)粒載體pIRES2-NGF-EGFP中。

1.5體外轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞

采用含有10%新生牛血清與100μg/mL青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)條件為37℃與CO2濃度為5%。細(xì)胞活力的測定采用臺酚藍(lán)的方法并且在所有的實(shí)驗(yàn)中活力均在95%以上，細(xì)胞以5x105/孔的數(shù)量接種入6孔板中，培養(yǎng)24h后達(dá)到60%～80%融合。然后我們將各孔HEK293細(xì)胞劃分為4個(gè)組，即空白對照組、pIRES2-EGFP轉(zhuǎn)染組、pIRES2-NGF/EGFP轉(zhuǎn)染組、pIRES2-NGF/NT-3轉(zhuǎn)染組，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染均采用（LipofectamineTM 2000）脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，每孔加入質(zhì)粒的量為5μg，在37℃條件下孵育2h。然后去除含有轉(zhuǎn)染液的上清，添加新鮮的含血清培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染72h后，確保倒置熒光顯微鏡觀察pIRES2-EGFP轉(zhuǎn)染組與pIRES2-NGF/EGFP，轉(zhuǎn)染組的轉(zhuǎn)染效率大于80%，然后收集各處理組上清液用于Western-blot檢測目的蛋白的表達(dá)，收集細(xì)胞裂解后用于RT-PCR檢測目的基因mRNA水平的表達(dá)。

每份收集的細(xì)胞加入1mL TRIZOL試劑反復(fù)吹打，提取細(xì)胞總RNA，按照說明書的步驟將提取的1μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。取2μL反轉(zhuǎn)錄的cDNA采用基因特異性引物（見表2）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并采用β-actin做內(nèi)參，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min； 94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 30s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃ 10min延伸。取5μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入1μL Loading buffer，100V電壓下在2%的瓊脂糖凝膠中電泳。采用凝膠分析系統(tǒng)拍攝，并對各條帶的灰度值進(jìn)行分析。

為了檢測各處理組HEK293細(xì)胞中NGF與NT-3蛋白水平的表達(dá)，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染72h后，我們采用Western-blot的方法檢測基因的表達(dá)。方法如下：即提取各處理組的HEK293細(xì)胞上清液，經(jīng)BCA法檢測蛋白濃度后行8%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜浸入含5%脫脂奶粉的TBST中，37℃慢搖lh（85r/min），一抗4℃過夜、二抗37℃孵育lh，加入凱基超敏型ECL檢測液進(jìn)行發(fā)光，在暗室中經(jīng)壓片、顯影、定影。條帶的灰度我們采用Gel-Pro analyzer軟件進(jìn)行分析。

1.6統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)用x±s表示，組間數(shù)據(jù)的差異比較采用單因素方差分析法，P<0.05為差異有顯著性意義。

2結(jié)果與分析

2.1 NGF與NT-3基因的擴(kuò)增

從人外周血單核細(xì)胞的基因組DNA通過PCR獲得NGF和NT-3基因，NGF基因的大小為726bp，NT-3基因的大小為774bp（圖2A）。

2.2pIRES2-NGF-EGFP質(zhì)粒的鑒定

質(zhì)粒載體pIRES2-NGF-EGFP被Xho I和BamH I雙酶切后進(jìn)行凝膠電泳，結(jié)果在726bp處出現(xiàn)一條目的條帶，與NGF基因大小完全一致（圖3）。

2.3pIRES2-NGF-NT-3雙基因表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

質(zhì)粒載體pIRES2-NGF-NT-3被Xho I和BamH I雙酶切后進(jìn)行凝膠電泳，結(jié)果在約726bp處出現(xiàn)一條目的條帶，與NGF基因大小完全一致；質(zhì)粒載體pIRES2-NGF-NT一3被Xho I和Not I雙酶切后，結(jié)果在約2106bp出現(xiàn)一條目的條帶與NGF-IRES-NT-3基因片段序列一致；質(zhì)粒載體pIRES2-NGF-NT-3被BamH I和Not I雙酶切后，結(jié)果在約l374bp出現(xiàn)一條目的條帶大小與IRES-NT-3基因片段一致。載體pIRES2一NGF-NT-3經(jīng)DNA測序后可知NGF與NT-3與基因庫中的序列順序完傘一致（圖4）。

2.4RT-PCR檢測NGF與NT-3的表達(dá)

采用RT-PCR方法檢測各處理組HEK293細(xì)胞中NGF與NT-3的mRNA表達(dá)，檢測采用NGF與NT-3特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，并以β一肌動(dòng)蛋白作為表達(dá)的內(nèi)參，采用倒置熒光顯微鏡觀察pIRES2-EGFP與pIRES2-NGF/EGFP轉(zhuǎn)染組的綠色熒光表達(dá)量約80%以上。提取總RNA逆轉(zhuǎn)錄采用基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳跑膠后利用光密度掃描軟件進(jìn)行表達(dá)量分析。結(jié)果顯示：NGF基因在pIRES2-NGF/EGFP與pIRES2-NGF/NT-3轉(zhuǎn)染組表達(dá)量明顯高于pIRES2-EGFP轉(zhuǎn)染組與空白對照組（圖5）。與上述方法相似，結(jié)果顯示NT-3基因在pIRES2-NGF/NT-3轉(zhuǎn)染組的表達(dá)量明顯高于其他3組（圖6）。結(jié)果顯示NGF與NT-3基因成功導(dǎo)入了HEK293細(xì)胞中并且得到了表達(dá)。

2.5Western-blot檢測NGF與NT-3的表達(dá)

采用Western-blot方法檢測各處理組HEK293細(xì)胞中NGF與NT-3的蛋白水平的表達(dá)，以β-肌動(dòng)蛋白一抗作為目的蛋白表達(dá)的內(nèi)參，即提取各處理組的HEK293細(xì)胞上清液，經(jīng)BCA法檢測蛋白濃度后行SDS-PAGE電泳分離后，電轉(zhuǎn)、抗體孵育，在暗室中經(jīng)壓片、顯影、定影。條帶的灰度我們采用Gel-Pro analyzer軟件進(jìn)行分析。采用倒置熒光顯微鏡觀察pIRES2-EGFP與pIRES2-NGF/EGFP轉(zhuǎn)染組的綠色熒光表達(dá)約80%以上結(jié)果顯示：NGF蛋白在pIRES2-NGF/EGFP與pIRES2-NGF/NT一3轉(zhuǎn)染組表達(dá)量明顯高于pIRES2-EGFP轉(zhuǎn)染組與空白對照組（圖7）。與上述方法相似，結(jié)果顯示NT-3蛋白在pIRES2-NGF/NT-3轉(zhuǎn)染組的表達(dá)量明顯高于其他3組（圖8）；NGF與NT-3基因成功導(dǎo)人了HEK293細(xì)胞中并且在蛋白質(zhì)水平得到了表達(dá)。

3討論

為了提高克隆的效率簡化克隆流程，我們采用孿生PCR的方法獲取插入的目的基因片段，該插入片段含有由一條單鏈的突出端形成的末端結(jié)構(gòu)，該末端結(jié)構(gòu)與酶切后的載體質(zhì)粒末端產(chǎn)生互補(bǔ)結(jié)構(gòu)。如圖l所示，PCR產(chǎn)物通過熱變性和退火的互補(bǔ)配對的方式進(jìn)行組裝，最后產(chǎn)生了4種類型數(shù)量相等的分子片段。其中兩個(gè)為平端結(jié)構(gòu)，兩個(gè)為粘性末端結(jié)構(gòu)。理論上來講，含有粘性末端結(jié)構(gòu)分子片段數(shù)量的一半可以用來適合某種連接反應(yīng)。采用孿生PCR策略，僅僅通過引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增的方法即可使得雜交后的PCR產(chǎn)物可以形成各種各樣的粘性末端結(jié)構(gòu)與幾乎所有的酶切后斷端片段發(fā)生互補(bǔ)。因?yàn)樵揚(yáng)CR產(chǎn)物作為插入片段無需進(jìn)行酶切反應(yīng)，所以其可以克服由于限制性內(nèi)切酶的敏感性而帶來的一系列問題。擴(kuò)增產(chǎn)生的插入片段內(nèi)部的酶切位點(diǎn)也不會限制克隆位點(diǎn)的選擇，這尤其適合于長PCR片段的克隆，因?yàn)榭寺〔迦氲钠卧介L，內(nèi)部含有的限制性酶切位點(diǎn)的數(shù)量和可能性就越多。

此實(shí)驗(yàn)將NT-3片段通過長短PCR產(chǎn)物退火的方法產(chǎn)生BstX I與Not I兩個(gè)酶切位點(diǎn)，并定向插入到質(zhì)粒載體pIRES2-NGF-EGFP中。這種克隆方法經(jīng)濟(jì)省時(shí)有效。此外我們在克隆過程中采用了高保真DNA聚合酶，保證了我們擴(kuò)增片段的精確性，這些優(yōu)勢使得孿生PCR技術(shù)廣泛地應(yīng)用于PCR產(chǎn)物的定向克隆當(dāng)中。在眾多的神經(jīng)營養(yǎng)因子（neurotrophic factors， NTFs）中，NGF是最受關(guān)注和重視的一種，它是一種兼有神經(jīng)元營養(yǎng)和促進(jìn)突起生長雙重生物學(xué)功能的細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子，對中樞和周圍神經(jīng)元的發(fā)育、分化、生長、再生和功能特性表達(dá)均具有重要調(diào)控作用。研究證實(shí)NGF對周圍神經(jīng)再生有密切關(guān)系，并起著重要作用。

在周圍神經(jīng)切斷處局部給予外源性NGF經(jīng)4-6h可逆行運(yùn)輸?shù)奖掣窠?jīng)節(jié)胞體，通過影響背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的新陳代謝，并將這一影響轉(zhuǎn)換成別的信息傳到脊髓聯(lián)絡(luò)神經(jīng)元，引起脊髓神經(jīng)生理和功能上的變化。NGF是具有調(diào)節(jié)神經(jīng)修復(fù)的活性分子。NGF屬于一種多聚體，主要包括α、β、γ3種亞型，其中β亞基上含有NGF的所有生物學(xué)活性。1）NGF能夠在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育期對神經(jīng)細(xì)胞的成熟以及存活產(chǎn)生促進(jìn)作用，也可有效控制神經(jīng)元存活數(shù)量；2）NGF在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育成熟期會將作用由調(diào)節(jié)神經(jīng)元的存活轉(zhuǎn)移至對神經(jīng)元的表現(xiàn)以及功能方面，可以使感覺神經(jīng)元以及中樞神經(jīng)元的功能得到維持；3）NGF可以對神經(jīng)纖維的定向生長進(jìn)行有效的促進(jìn)，而且會使神經(jīng)纖維再生得到加速，有效促進(jìn)了雪旺氏細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞的生長，促進(jìn)髓鞘的修復(fù)，對軸突、樹突的發(fā)育產(chǎn)生積極的誘導(dǎo)，從而使神經(jīng)元的有絲分裂、分化、修復(fù)得到促進(jìn)，能夠有效降低神經(jīng)細(xì)胞死亡率，避免受損神經(jīng)元遭到繼續(xù)損害，對神經(jīng)元的存活產(chǎn)生了促進(jìn)作用。

神經(jīng)營養(yǎng)因子是能支持神經(jīng)元存活，促進(jìn)其生長、分化及維持其功能的一類因子。NT-3是在1990年利用NGF與BDNF序列同源性被發(fā)現(xiàn)的NTF，NT-3與NGF、BDNF一樣出現(xiàn)在胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生的時(shí)候。脊髓損傷后NT-3的表達(dá)與損傷前相比均有所提高，說明受損脊髓對NT-3內(nèi)源性需求增加。NT-3是在脊髓中作用最強(qiáng)神經(jīng)營養(yǎng)因子，它可以明顯促進(jìn)皮質(zhì)脊髓束的再生和神經(jīng)元的存活、遷移與軸突生長。體外研究表明，NT-3可維持交感、感覺、基底前腦膽堿能和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活，能在體外上調(diào)膽堿能神經(jīng)元乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)，支持中腦多巴胺能神經(jīng)元分化，以及促進(jìn)發(fā)育和損傷的CST側(cè)枝出芽。由于NT-3不能透過血腦屏障，只能局部給藥，而在損傷局部持續(xù)給藥必須通過反復(fù)室管膜內(nèi)注射或借助于侵襲性微管裝置，實(shí)際應(yīng)用極不方便。研究證明，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可使含有神經(jīng)營養(yǎng)作用基因的細(xì)胞不斷分泌所需營養(yǎng)因子，促使神經(jīng)再生和功能恢復(fù)。

本組實(shí)驗(yàn)利用真核表達(dá)載體共表達(dá)神經(jīng)生長因子和神經(jīng)營養(yǎng)素3轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，結(jié)果顯示HEK293細(xì)胞能高效表達(dá)神經(jīng)生長因子和神經(jīng)營養(yǎng)素3，為利用細(xì)胞作為載體傳送神經(jīng)生長因子和神經(jīng)營養(yǎng)素3至脊髓損傷部位提供依據(jù)。此外，本組實(shí)驗(yàn)還具有以下特點(diǎn)：1）在同一個(gè)真核表達(dá)載體里編碼兩個(gè)基因，利用內(nèi)部核酸進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）序列，將神經(jīng)生長因子和神經(jīng)營養(yǎng)素3兩個(gè)基因連接，受一個(gè)啟動(dòng)子CMV調(diào)控后，兩個(gè)基因均獲得有效表達(dá)。盡管IRES是一種常用的雙基因表達(dá)載體的構(gòu)成元件，但在不同的體系下，IRES連接的兩個(gè)基因的表達(dá)水平并不完全一致，常常是靠近啟動(dòng)子的基因表達(dá)水平高，而IRES下游的基因表達(dá)水平較低，甚至不能有效地表達(dá)。而本組實(shí)驗(yàn)中證實(shí)用IRES連接神經(jīng)生長因子和神經(jīng)營養(yǎng)素3均能獲得高效的表達(dá)；2）以神經(jīng)生長因子和神經(jīng)營養(yǎng)素3和人間充質(zhì)干細(xì)胞以及真核表達(dá)載體作為研究對象，可能更有利于脊髓損傷后的神經(jīng)再生與重建，更利于研究結(jié)果向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化，首先在體外感染細(xì)胞載體的方法避免了真核表達(dá)載體直接體內(nèi)注射所帶來的安全隱患以及異源性基因直接導(dǎo)入所產(chǎn)生的倫理學(xué)問題。在脊髓損傷修復(fù)的研究中，細(xì)胞承擔(dān)著兩種角色：靶細(xì)胞或者載體細(xì)胞。靶細(xì)胞是通過細(xì)胞替代再生組織，重建神經(jīng)通路起作用。載體細(xì)胞是被作為基因表達(dá)或者治療性因子釋放的媒介，促進(jìn)神經(jīng)工程恢復(fù)起作用。綜合目前的研究，間充質(zhì)干細(xì)胞具備作為靶細(xì)胞和載體細(xì)胞的特點(diǎn)，非常適合于基因治療脊髓損傷的研究。目前用于基因治療的常用載體有病毒類載體與非病毒類載體兩大類。雖然病毒類載體有轉(zhuǎn)染效率高，表達(dá)穩(wěn)定等特點(diǎn)，但容易整合到靶細(xì)胞的染色體內(nèi)，因此安全性差，需謹(jǐn)慎使用；非病毒載體主要為各種質(zhì)粒，進(jìn)入靶細(xì)胞后以附加體的形式存在，具有安全性好，容量大的優(yōu)點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)采用pIRES2-EGFP真核表達(dá)載體，通過基因重組的方法成功構(gòu)建出神經(jīng)生長因子和神經(jīng)營養(yǎng)素3真核表達(dá)載體，并且證明這兩個(gè)基因能在HEK293細(xì)胞中共表達(dá)。查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)，目前尚無利用神經(jīng)生長因子和神經(jīng)營養(yǎng)素3促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞分化修復(fù)脊髓損傷的基因治療研究，我們計(jì)劃在下一步的實(shí)驗(yàn)研究中，將該雙基因表達(dá)的質(zhì)粒pIRES2-NGF-NT-3轉(zhuǎn)染入間充質(zhì)干細(xì)胞中，并獲取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。我們推測雙基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞在促進(jìn)神經(jīng)元再生方面相對于單基因而言可能效果會更加顯著。