李欣 王利平 杜琳 楊麗鵬 喬家駒 李紅玉 馮漢青

摘要：OxyR調(diào)節(jié)子是最早發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌抗氧化防御系統(tǒng)之一，大腸桿菌oxyR調(diào)節(jié)子中參與抗氧化作用的基因成員包括katG、ahpC、ahpF等，通過對(duì)H2O2及過氧化物等的直接清除方式發(fā)揮作用。雖然該方面的研究很多，但對(duì)于大腸桿菌oxyR調(diào)節(jié)子對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的影響尚不清楚。通過對(duì)大腸桿菌oxyR、ahpCF、katE/G基因突變菌株進(jìn)行研究，突變體JI370中ahpCF基因缺失導(dǎo)致其內(nèi)源H2O2積累減少使其生長(zhǎng)相應(yīng)加快，而對(duì)于katG和katE基因突變體JI367和ahpCF、oxyR基因突變體LC74來說，胞內(nèi)H2O2極顯著上升會(huì)抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，并且H2O2積累量越大對(duì)其生長(zhǎng)抑制作用越明顯。與野生型菌株相比，ahpCF的缺失突變菌株JI370和ahpCF及oxyR雙突變的LC74在菌株生長(zhǎng)的潛伏期受到更顯著的影響。結(jié)果表明：在CAT（catalase，CAT）與AHP（alkylhydroperoxide reductase，AHP）協(xié)同清除內(nèi)源H2O2的作用中，AHP起到主導(dǎo)作用，并且在細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖中，ahp基因起到重要的作用。

關(guān)鍵詞：過氧化氫酶；過氧化氫；大腸桿菌；生長(zhǎng)繁殖

中圖分類號(hào)：Q935

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-7847（2014）04-0323-04

活性氧是生物體有氧代謝產(chǎn)生的一類具有較強(qiáng)氧化能力的含氧化合物，包括超氧陰離子、羥自由基等自由基物質(zhì)和過氧化氫（H2O2）、單線態(tài)氧等非自由基物質(zhì)。H2O2作為生物體信號(hào)的同時(shí)也會(huì)對(duì)生物體造成嚴(yán)重的傷害，因此生物體拮抗H2O2的機(jī)制研究一直是生物學(xué)研究的重點(diǎn)之—。

病原細(xì)菌對(duì)H2O2的降解（即抗氧化）是侵染中的重要毒性機(jī)制之一。經(jīng)報(bào)道細(xì)菌抗氧化系統(tǒng)是細(xì)菌抵抗呼吸作用及環(huán)境因素導(dǎo)致的氧化損傷的一套防衛(wèi)系統(tǒng)，oxyR調(diào)節(jié)子則是最早發(fā)現(xiàn)的具有抗氧化作用的系統(tǒng)之一。它是LysR家族的部分蛋白的轉(zhuǎn)錄激活子，存在氧化型和還原型兩種狀態(tài)，通過兩種狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)化，識(shí)別H2O2，能夠調(diào)控過氧化氫酶（catalase，CAT）和烷基過氧化物還原酶（alkyl hydroperoxide reductase，AHP）的表達(dá)。大腸桿菌能產(chǎn)生兩種過氧化氫酶（CAT）：HP I （katG基因產(chǎn)物）和HPⅡ（katE基因產(chǎn)物），兩者在結(jié)構(gòu)、動(dòng)力學(xué)特性和調(diào)控機(jī)制方面存在顯著差異。但任何一種基因的缺失都會(huì)導(dǎo)致自然突變率的增加和H2O2敏感性的上升，CAT主要是清除菌體內(nèi)高濃度的H2O2。烷基過氧化物還原酶（AHP）由22kD的C催化亞基和56kD的F還原亞基組成，能夠以NADPH或NADH作為協(xié)同因子參與被氧化的ahpC的再生，是大腸桿菌內(nèi)源過氧化氫的最初清除劑，能夠清除菌體內(nèi)低濃度的H2O2，它能與具有高Km的CAT協(xié)同調(diào)控胞內(nèi)H2O2濃度。

細(xì)菌中oxyR及其介導(dǎo)的抗氧化體系研究有一定進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)室前期工作中發(fā)現(xiàn)細(xì)菌內(nèi)源H2O2與細(xì)菌的繁殖密切相關(guān)，但是，oxyR介導(dǎo)的抗氧化體系在細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖中的作用還未見報(bào)道。作者以oxyR、ahp、kat基因突變株為研究對(duì)象，嘗試探討oxyR基因簇中各基因在細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖中的協(xié)同作用，為細(xì)菌抗氧化調(diào)控機(jī)制的研究提供科學(xué)證據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

大腸桿菌野生型菌株MG1655、ahp基因C和F亞基的雙突變菌株JI370（（ahpC-ahpF'） del kan：：'ahpF）、ahp基因C和F亞基以及oxyR基因共同缺失的突變菌株LC74 （delOxyR：spec （ahpC-ahpF'）del kan：：'ahpF），均由美國(guó)伊利諾斯州立大學(xué)的Imlay教授惠贈(zèng)。將凍干保存的上述菌株取干粉劃線接種到LB平板上，37℃下培養(yǎng)16h以上，挑單菌落至LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至菌液渾濁，甘油保存菌種，備用。

1.2主要試劑

熒光染料AR（amplex Red），辣根過氧化物酶（HRP）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。過氧化氫酶（CAT）、過氧化氫、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀購(gòu)自上海生工公司，所用化學(xué)試劑均為分析純。

1.3熒光法檢測(cè)內(nèi)源H2O2

培養(yǎng)大腸桿菌野生型和突變體菌株至對(duì)數(shù)期，離心收集菌體，用無菌水重懸15min，備用。1mg AR溶解于0.75mL DMSO中，避光保存。用50mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH=7.8）溶解HRP形成終濃度為0.02g/L酶液。測(cè)定H2O2時(shí)，用0.45mL的待測(cè)樣品液與0.25mL AR和0.25mL HRP混合，采用F-4500熒光分光光度計(jì)檢測(cè)其熒光強(qiáng)度，并用標(biāo)準(zhǔn)液做出標(biāo)準(zhǔn)曲線轉(zhuǎn)換為H2O2濃度。采用激發(fā)波長(zhǎng)525nm，發(fā)射波長(zhǎng)550～650nm。

1.4CAT處理

菌株接種后在不同時(shí)間點(diǎn)加入初始濃度為15U/mL的CAT（文中所提CAT均為此濃度），搖勻，繼續(xù)37℃振蕩培養(yǎng)。

1.5生長(zhǎng)曲線測(cè)定

420nm下，可見分光光度法進(jìn)行光電比濁測(cè)定，檢測(cè)時(shí)稀釋菌懸液，將吸光值控制在0～0.4之間，按前期實(shí)驗(yàn)中建立的吸光值與菌細(xì)胞數(shù)對(duì)應(yīng)關(guān)系（每0.1吸光值菌落數(shù)為3.65xl08/mL）計(jì)算菌細(xì)胞數(shù)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。獨(dú)立樣本間的差異顯著性分析用Nonparametric Tests，包括Mann-Whitney Test、Moses Test、Two-Sample Kol-mogorov-Smirnov Test和Wald-Wolfowitz Test。T檢驗(yàn)判定檢驗(yàn)結(jié)果：P>0.05，不顯著；P<0.05，顯著；P

2結(jié)果

2.1基因突變和CAT處理引起H2O2變化

比較圖1中對(duì)照組可以看出，3個(gè)不同基因突變體菌株中內(nèi)源H2O2水平不同。與野生型菌株MG1655相比，ahp和oxyR功能同時(shí)缺失的突變體菌株LC74中H2O2水平有極顯著升高（P

加入CAT后培養(yǎng)至16h，突變體JI370、JI367、LC74內(nèi)源H2O2含量下降，但下降均不顯著（P>0.05）。

2.2H2O2變化對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的影響

2.2.1不同突變體生長(zhǎng)曲線

在細(xì)胞生長(zhǎng)初期，野生型MG1655與突變體JI370生長(zhǎng)曲線相近，但突變體JI367和LC74穩(wěn)定期的菌細(xì)胞濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于MG1655和JI370，表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)緩慢。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期至穩(wěn)定期，野生型與突變體JI370生長(zhǎng)接近，但遠(yuǎn)高于突變體JI367和LC74。且突變體LC74出現(xiàn)明顯的對(duì)數(shù)期延遲（圖2）。

2.2.2CAT作用時(shí)間點(diǎn)不同對(duì)野生型菌株生長(zhǎng)的影響

與對(duì)照組相比，4、7、10、13h加入CAT，在15h時(shí)測(cè)定菌株MG1655菌細(xì)胞數(shù)分別下降了22.22%、10.63%、7.97%、1.25%。即4h加入CAT對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)抑制率最大。因此，菌株培養(yǎng)至4h時(shí)為加入CAT的最佳作用時(shí)間點(diǎn)。

2.2.3CAT處理對(duì)突變體生長(zhǎng)曲線的影響

在野生型及突變體菌株接種后培養(yǎng)4h時(shí)加入CAT，進(jìn)一步明確CAT處理后不同基因突變體菌株的反應(yīng)差異。由圖3可知，CAT對(duì)MG1655、JI370、JI367、LC74生長(zhǎng)抑制作用明顯，并且對(duì)4種菌株的抑制程度不同。由對(duì)照和CAT處理后菌株生長(zhǎng)的差值可清晰地看出，CAT對(duì)JI370的抑制作用最大，LC74次之，對(duì)數(shù)期（8～13h）抑制作用最為明顯，第8h抑制作用最大，呈現(xiàn)逐步下降的趨勢(shì)。CAT對(duì)MG1655的抑制程度最小，穩(wěn)定期（21～37h）抑制作用明顯，衰亡期的抑制作用降低。

3討論

JI370是在野生型菌株中敲除ahpC和F基因的雙突變體，本實(shí)驗(yàn)室的前期結(jié)果顯示其細(xì)胞中AHP的缺失誘導(dǎo)了CAT的活性出現(xiàn)反饋性的顯著提高，導(dǎo)致胞內(nèi)H2O2的水平顯著降低（圖1）.Imlay教授的研究結(jié)果顯示：ahpCF突變株總CAT含量比野生型菌株高7倍，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。在黃單胞菌，銅綠假單胞菌中，研究者均發(fā)現(xiàn)ahp突變誘導(dǎo)CAT產(chǎn)生，多種細(xì)菌中均存在CAT和AHP合成之間的相互補(bǔ)償作用，LC74是ahpC/F， oxyR的三突變體，oxyR基因的突變，導(dǎo)致細(xì)菌無法識(shí)別外源和內(nèi)源的H2O2，不能啟動(dòng)H2O2降解機(jī)制，導(dǎo)致H2O2分子在體內(nèi)發(fā)生積累（圖1）。結(jié)果顯示3個(gè)突變體H2O2積累量不同，生長(zhǎng)情況亦不同（圖2）。與野生型相比，突變株JI370沒有明顯的生長(zhǎng)缺陷，并且在對(duì)數(shù)期更快速的生長(zhǎng)，作者推測(cè)是細(xì)胞通過katG充分誘導(dǎo)CAT活性的上升，以補(bǔ)償ahpCF引起的損失；突變體JI367胞內(nèi)H2O2有所積累，推測(cè)其積累量影響菌株正常生長(zhǎng)，所以生長(zhǎng)速度明顯下降；而突變體LC74胞內(nèi)H2O2大量積累，當(dāng)其積累到一定濃度時(shí)，開始抑制細(xì)胞的正常生長(zhǎng)繁殖，這很可能是LC74生長(zhǎng)緩慢的原因。綜上可知：oxyR基因簇調(diào)控下的不同突變體在正常生長(zhǎng)過程中，細(xì)菌內(nèi)源H2O2積累量與生長(zhǎng)抑制程度成負(fù)相關(guān)，暗示抗氧化體系相關(guān)基因表達(dá)的變化，不僅影響H2O2的水平，更影響菌株整體的生長(zhǎng)與繁殖。

過氧化氫酶（CAT）處理的進(jìn)一步的結(jié)果顯示：CAT對(duì)kat基因缺失菌株JI367的影響與野生型菌株類似，整個(gè)生長(zhǎng)期影響較小，其中對(duì)數(shù)期的菌液濃度下降最為明顯。顯示抗氧化基因?qū)?xì)菌維持正常的生長(zhǎng)繁殖具有積極的作用。野生型菌株胞內(nèi)正常的抗氧化系統(tǒng)基因表達(dá)，能夠調(diào)控胞內(nèi)維持較為穩(wěn)定的氧化和抗氧化平衡。暗示kat對(duì)于內(nèi)源H2O2的作用不大，在生長(zhǎng)繁殖中的調(diào)控作用也不明顯。與Imlay教授等提出CAT主要清除外源H2O2的結(jié)論相符。

與野生型菌株相比，ahpCF的缺失突變菌株JI370和ahpCF及oxyR雙突變的LC74在菌株生長(zhǎng)的潛伏期受到更顯著的影響。說明在CAT與AHP的協(xié)同作用中，AHP起到主導(dǎo)作用，并且在細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖中，ahp基因至關(guān)重要。

綜上可知，在ahp、kat、oxyR基因協(xié)調(diào)H2O2積累作用中，ahp基因?qū)?nèi)源H2O2的調(diào)控起主導(dǎo)作用，oxyR基因起誘導(dǎo)、補(bǔ)償作用。因此，在大腸桿菌生長(zhǎng)繁殖過程中，oxyR作為一個(gè)全局性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，介導(dǎo)和調(diào)控oxyR、kat和ahp基因，并通過其相互協(xié)同作用，識(shí)別調(diào)控H2O2，影響菌株整體的生長(zhǎng)與繁殖。

本實(shí)驗(yàn)室前期結(jié)果證明，黃單胞菌中H2O2的產(chǎn)生與細(xì)胞分裂進(jìn)程密切相關(guān)，并對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)起到積極作用。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，oxyR基因簇突變和CAT處理都會(huì)引起菌體內(nèi)H2O2水平變化，并影響其生長(zhǎng)繁殖情況。在細(xì)胞中，H2O2的積累可能具有更為復(fù)雜的意義。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究H2O2在胞內(nèi)作用的細(xì)胞時(shí)期，深入研究細(xì)胞增殖中H2O2時(shí)空定位變化的機(jī)制提供了理論支持，也為深入研究oxyR基因簇的功能提供了新的思路。