李瑩 臧淑英 馬大龍 鄂立思

松江濕地為松花江河漫灘地，地勢平緩，依托松花江呈東西向帶狀分布，包括松花江灘涂濕地和支流河口濕地在內(nèi)的廣闊濕地資源，是全國面積最大的原生態(tài)城市濕地。濕地內(nèi)植物區(qū)系組成多樣，生物多樣性豐富，是黑龍江省哈爾濱市重點保護、開發(fā)、建設的生態(tài)文明區(qū)，也是近年來較重視的生態(tài)研究區(qū)。微生物是濕地生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在濕地養(yǎng)分的生物地球化學循環(huán)中往往起著核心作用，濕地沉積物中的微生物以細菌為主，細菌能參與濕地污染物和有毒物質(zhì)的降解過程，有助于保持濕地生態(tài)系統(tǒng)的平衡和提高濕地自凈能力。松江濕地的內(nèi)部環(huán)境和結構較復雜，沉積物中蘊含著豐富的微生物資源，其細菌組成結構能良好地反應濕地環(huán)境因子的變化，深層次理解松江濕地生態(tài)系統(tǒng)結構和功能，而建立優(yōu)化PCR體系是利用T-RFLP技術分析微生物資源的前提條件。

末端限制性片段長度多態(tài)性（terminal restric-tion fragment length polymorphism， T-RFLP），又稱為16S rRNA基因的末端限制性片段（terminal re-striction fragment，TRF）分析技術，是建立在PCR基礎之上研究微生物多樣性的一種新興分子生物學研究方法，不依賴于培養(yǎng)即可對微生物進行群落結構分析，具有非常廣闊的應用前景。T-RFLP技術具有快速、高度的可重復性、良好的可操作性和產(chǎn)生大量的可操作單元（OTUs），能夠與數(shù)據(jù)庫建立直接聯(lián)系，用于微生物菌種鑒定、群落的對比和多樣性分析。本研究對在松江濕地沉積物細菌T-RFLP分析過程中，PCR擴增體系的相關影響因素進行優(yōu)化和篩選，建立適于濕地沉積物的簡單、高效和穩(wěn)定的PCR反應體系，為進一步開展沉積物細菌群落結構研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料與試劑

沉積物于2012年8月采自松江濕地哈爾濱段，采集深度為0～20cm，將沉積物用無菌塑料袋密封帶回實驗室，-20℃冷藏。

PCR試劑所用試劑Taq酶、Mg2+、dNTPs和標準相對分子質(zhì)量Marker（簡寫為M） DL2000均購自TaKaRa大連寶生物工程有限公司，引物由上海生物工程有限責任公司合成。

1.2試驗方法

DNA提取及檢測：采用MOBIO土壤微生物DNA強力提取試劑盒對0.25g沉積物進行微生物總DNA提取，具體方法按照制造商的說明使用，所提取的DNA用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測其純度。

PCR擴增程序與正交試驗設計：采用細菌16S rRNA基因通用引物8F（5'-AGAGTTTGATC-CTTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGT-TACGACTT-3'）進行PCR擴增，正向引物8F用6-FAM（羧基熒光素）標記在5'的末端。

PCR擴增程序如下：95℃預變性5min， 95℃變性30s，56℃復性30s，72℃延伸1min，循環(huán)34次。最后72℃延伸7min，4℃保存。PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳緩沖液為lxTAE，205V穩(wěn)壓電泳8min，在紫外光成像系統(tǒng)下照相并記錄分析。

在進行單因子試驗分析影響因素之后，為快速準確地確定PCR最優(yōu)反應體系，采用L16（45）正交設計，對PCR 5個因素（模板DNA、Mg2+、Taq酶、dNTPs、引物）在4個水平上進行試驗，20μL擴增反應體系（見表1）。

2結果與分析

2.1單因子試驗與分析

2.1.1模板DNA含量

模板DNA的濃度與純度是PCR是否成功的關鍵因素之一，DNA含量過高，會結合Mg2+，降低Taq酶的活性，產(chǎn)生非特異性擴增；DNA含量過少，PCR產(chǎn)物少且不穩(wěn)定甚至無擴增。由圖1電泳結果可知，DNA含量在l0～40ng之間均可擴增出條帶，DNA含量在10ng時條帶弱且不清晰，增加到20～40ng時條帶均亮，所以選擇20～40ngDNA含量為最佳。

2.1.2Mg2+濃度

Mg2+對PCR擴增的產(chǎn)量和特異性有顯著的影響，還能與反應液中的dNTPs、模板DNA及引物相結合，影響引物與模板的結合效率、模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度和產(chǎn)物的特異性及引物二聚體的形成。Mg2+濃度過高會降低PCR反應的特異性，出現(xiàn)非特異性產(chǎn)物；濃度過低會抑制Taq酶活性，降低PCR擴增產(chǎn)量。由圖2電泳結果可知，Mg2+濃度在2.5mmol/L時條帶顏色淺；2.0mmol/L時條帶較亮；當降低到1.5、1.0mmol/L時條帶逐漸變淺且彌散。因此，Mg2+最佳濃度為2.0mmol/L。

2.1.3dNTPs濃度

dNTPs是PCR擴增反應的原料，其濃度過高時，會導致聚合酶錯誤的摻入，并引起堿基錯配，降低PCR擴增的忠實性；濃度過低時，又會影響合成效率。由圖3電泳結果可知，dNTPs在2.5mmol/L時條帶模糊小清晰，在2.0～1.0mmol/L之間時，隨濃度降低條帶逐漸變亮，所以dNTPs濃度選在2.0mmol/L時效果為最佳。

2.1.4引物濃度

引物是PCR特異性反應的關鍵因素之一，PCR擴增產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA結合的程度。引物濃度偏低會減少與模板DNA的結合率，使擴增效果降低；引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，容易增加形成引物二聚體的機會。由圖4電泳結果可知，當引物濃度在0.2-0.15μmol/L之間時條帶均亮，尤以0.2μmol/L最佳，擴增效果較好，引物濃度降低到0.1μmol/L時條帶淺且彌散嚴重。

2.1.5Taq酶濃度

Taq酶用量偏低會使合成的效率降低，導致擴增產(chǎn)物減少；用量過高不儀造成浪費，而且會導致非特異性片段產(chǎn)物的積累，不易形成良好的擴增效果。從圖5電泳結果可知，Taq酶含量在2.0、1.5、1.0、0.5U時條帶均亮且明顯，但從擴增效果和經(jīng)濟性兩方面考慮，Taq酶濃度在0.5U時為最佳選擇。

2.2正交試驗結果與分析

按表l設計的16個PCR反應組合進行正交試驗，擴增結果如圖6所示。根據(jù)電泳檢測結果，將16個處理按擴增條帶強弱、背景顏色深淺和條帶彌散程度打分。條帶清晰亮度大、背景顏色淺、無彌散與特異性條帶的最佳效果為16分，相反最差為1分。1～16組合的分數(shù)依次是：1、2、8、9、1、l、10、1、2、14、16、15、4、6、13、13。

通過分數(shù)求出各列各水平的和，可求知各水平的平均值（見表2）。然后用各列最大平均值減最小平均值求出極差R，極差值越大表示該因素影響程度越大。由極差可知，PCR反應中各因素影響力大小依次為：Mg2+>DNA模板>Taq酶>dNTPs>引物，其中正交試驗的最佳反應組合是11號：DNA模板30ng，Mg2+ 2.0mmol/L，dNTPs 0.2mmol/L，引物0.2μmol/L，Taq酶0.5U。

3討論

松江濕地沉積物細菌結構的組成、分布、變化不僅是其自身生物特征的反映，也是其對周圍環(huán)境因素的一種響應。由于近年來旅游資源的開發(fā)，人為干涉因素增多，松江濕地的環(huán)境因素變化較大，其沉積物中的微生物結構也會發(fā)生相應改變。T-RELP分析技術是建立在PCR基礎之上研究微生物多樣性的一種新興分子生物學研究方法，不依賴于原始培養(yǎng)可較快地對微生物群落結構進行分析。利用T-RELP分析技術對松江濕地沉積物細菌結構進行分析，能更好地反映松江濕地生態(tài)系統(tǒng)的現(xiàn)狀，而建立一個良好的PCR體系是后續(xù)研究的必要基礎。

由于T-RELP是建立在PCR基礎之上的分子技術，如果對其在DNA提取、PCR擴增等過程中的技術細節(jié)不注意，則有可能對T-RFLP分析結果產(chǎn)生誤差。DNA提取是PCR擴增反應的前提，其純度和質(zhì)量是整個試驗的基礎和關鍵，由于試驗樣品的差異，會使每次提取的DNA純度有所不同，從而影響PCR反應體系的建立。另外，由于基因組DNA相對分子質(zhì)量較大，在DNA提取過程中會因動作劇烈、槍頭空間小等原因使基因片段發(fā)生斷裂，因此，為獲得完整的DNA片段，在試驗過程中應盡量避免劇烈震蕩。

在PCR擴增程序中，模板DNA濃度、dNTPs濃度、Mg2+濃度、引物濃度和Taq酶都會不同程度的影響反應結果。其中，Mg2+是Taq DNA聚合酶活性的激活劑，影響酶的活性與忠實性，Mg2+還能與模板和引物結合，從而影響引物與模板的結合效率及引物二聚體的形成。DNA模板含量是PCR擴增反應的關鍵因素之一，DNA量過高會導致非特異性片段的出現(xiàn)，模板量過低會降低反應效率。dNTPs、引物的質(zhì)量和濃度與PCR擴增效率也有著密切關系，過低或過高都會影響擴增效率，甚至會阻止反應進行。

試驗結果表明，不同的反應體系會對PCR擴增效果產(chǎn)生較大影響，合理的PCR反應條件是進行擴增與后續(xù)T-RELP分析的基礎。因此，在PCR擴增反應試驗過程中運用單因子試驗與正交設計進行體系優(yōu)化，結合正交試驗圖表結果分析各因素間的相關性，可快速準確地識別出反應中的關鍵影響因素。與單因素試驗相比，正交試驗能更標準、快速地找到目標最優(yōu)化體系，且試驗重復少、客觀準確性高、代表性強，現(xiàn)已被廣泛運用于PCR體系優(yōu)化試驗中。通過單因子試驗與正交設計對PCR擴增反應中各因素的比較，確立沉積物細菌T-RFLP分析中PCR反應中最優(yōu)體系為：DNA模板30ng，Mg2+ 2.0mmol/L， dNTPs 0.2mmol/L，引物0.2μmol/L，Taq酶0.5U。此反應體系重復性好、穩(wěn)定性強，可較好地應用到后續(xù)的T-RELP分析中，為今后開展松江濕地沉積物微生物的相關研究奠定了良好基礎。