宋倩 錢紹方 陳宣欽 陳麗梅 李昆志

摘要：鋁毒是酸性土壤作物生長(zhǎng)的主要限制因素。前期研究發(fā)現(xiàn)，鋁脅迫下，耐鋁型丹波黑大豆SSH（sup-pression subtractive hybridization，SSH） cDNA文庫(kù)中bHLH30轉(zhuǎn)錄因子基因上調(diào)表達(dá)，推測(cè)該基因與丹波黑大豆耐鋁性相關(guān)?？寺mbHLH30基因，構(gòu)建GmbHLH30植物表達(dá)載體pK2-35S-GmbHLH30，并在煙草中過(guò)量表達(dá)獲得轉(zhuǎn)GmbHLH30的轉(zhuǎn)基因煙草植株。在鋁脅迫下，轉(zhuǎn)GmbHLH30的轉(zhuǎn)基因煙草相對(duì)根伸長(zhǎng)率比野生型煙草大，可溶性糖和脯氨酸含量高，H2O2水平低。表明GmbHLH30基因的過(guò)量表達(dá)可以增強(qiáng)植物的耐鋁能力，暗示GmbHLH30轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控植物的耐鋁特性。

關(guān)鍵詞：黑大豆：bHLH30； 鋁脅迫； 轉(zhuǎn)基因煙草； 鋁耐受性

中圖分類號(hào)：Q945.78

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-7847（2014）04-0332-06

鋁毒害是酸性土壤限制植物生長(zhǎng)的主要因子：鋁通常以無(wú)毒害的氧化物和鋁硅酸鹽的形態(tài)存在土壤中。然而，當(dāng)土壤的pH<5時(shí)，鋁從土壤中溶解出來(lái)，形成有毒害的Al3+。當(dāng)Al離子濃度達(dá)到微摩爾濃度時(shí)，Al3+就能抑制植物的根生長(zhǎng)，影響對(duì)養(yǎng)分的吸收，從而影響植物生長(zhǎng)。

已有研究證實(shí)植物能夠通過(guò)分泌有機(jī)酸、酚類化合物、磷酸等物質(zhì)在一定程度上抵抗鋁的毒害作用。Miyasaka等發(fā)現(xiàn)在不含鋁的營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)8d的菜豆暴露在鋁脅迫條件下時(shí)，鋁耐受型的菜豆根際的檸檬酸含量是未經(jīng)鋁處理菜豆的70倍；無(wú)論鋁敏感型菜豆是否經(jīng)過(guò)鋁脅迫處理，其根際的檸檬酸含量是鋁處理過(guò)的耐受性菜豆的十分之一，因此認(rèn)為檸檬酸能在一定程度上減緩鋁對(duì)植物的毒害作用。此外，Kidd等報(bào)道鋁能夠誘導(dǎo)玉米中的兒茶酚和黃酮類的酚醛樹(shù)脂（槲皮黃酮）的釋放。

植物對(duì)鋁的耐受機(jī)制，根本上是由遺傳機(jī)制調(diào)控的。在鋁脅迫環(huán)境條件下，某些基因特異性表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物可能參與到耐鋁信號(hào)途徑中，或者作為酶調(diào)節(jié)一些代謝途徑，從而增強(qiáng)植物對(duì)鋁的耐受性。植物轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育及其對(duì)外界環(huán)境的反應(yīng)中起著重要的作用。堿性螺旋一環(huán)一螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH）轉(zhuǎn)錄因子普遍存在于真核生物中，具有兩個(gè)功能區(qū)。位于N端的堿性區(qū)域，又稱為亮氨酸拉鏈區(qū)域，主要參與DNA結(jié)合；在C端為HLH區(qū)域，主要為二聚化區(qū)域，形成同源或異源二聚體。bHLH轉(zhuǎn)錄因子的亮氨酸拉鏈區(qū)域能夠識(shí)別DNA的核心序列基序，包括已知的E-box （5'-CANNTG-3'），及最常見(jiàn)G-box（5'-CACGTG-3'）。bHLH轉(zhuǎn)錄因子參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程、植物激素信號(hào)途徑以及非生物脅迫等過(guò)程。擬南芥中的bHLH92轉(zhuǎn)錄因子在NaCl、干旱、甘露糖醇以及冷處理實(shí)驗(yàn)中都具有較高的表達(dá)量，說(shuō)明了bHLH92能夠響應(yīng)非牛物脅迫。水稻中的RERJ1基因，編碼bHLH轉(zhuǎn)錄因子，該轉(zhuǎn)錄因子能夠響應(yīng)機(jī)械損傷和干旱脅迫。酵母中的PHO4的磷酸化與去磷酸化作用控制PHO的調(diào)節(jié)作用，PHO4是一個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子，它能與第二個(gè)轉(zhuǎn)錄因子PHO2相互作用，在磷饑餓條件下調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)。然而，bHLH轉(zhuǎn)錄因子對(duì)抗鋁毒性的研究很少見(jiàn)報(bào)道。

在先前的研究中，用鋁對(duì)丹波黑大豆（鋁耐受性）和云南小黑豆（鋁敏感型）進(jìn)行脅迫處理，然后通過(guò)正向SSH cDNA文庫(kù)分析，發(fā)現(xiàn)在丹波黑大豆的SSH cDNA文庫(kù)中bHLH30轉(zhuǎn)錄因子的基因呈上調(diào)表達(dá)，但是在云南小黑豆中并沒(méi)有出現(xiàn)這個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的基因。因此，我們推測(cè)GmbHLH30轉(zhuǎn)錄因子可能參與到大豆對(duì)鋁毒的抵御途徑中。本研究從丹波黑大豆中克隆出GmbHLH30基因，構(gòu)建植物表達(dá)載體pK2-35S-GmbHLH30，并在煙草中過(guò)量表達(dá)CmbHLH30基因，對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草的相對(duì)根伸長(zhǎng)率、可溶性糖含量、脯氨酸含量以及過(guò)氧化氫含量進(jìn)行測(cè)定，以鑒定轉(zhuǎn)基因煙草是否具有耐鋁性，從而揭示丹波黑大豆bHLH30轉(zhuǎn)錄兇子基因耐鋁毒的功能。

1材料與方法

1.1植物材料的培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)采用從日本引進(jìn)的鋁耐受型丹波黑大豆（Tamba）作為實(shí)驗(yàn)材料，在25℃恒溫條件下將大豆催芽，待其萌發(fā)后挑選生長(zhǎng)狀況一致的豆芽進(jìn)行水培。選取生長(zhǎng)14d形態(tài)大小均一致的幼苗，用0.5mmol/L pH4.5的CaCl2溶液預(yù)處理12h后，再用50μmol/L pH4.5的AlCl3溶液（含0.5mmol/L CaCl2）分別處理大豆0、2、4、8、12、24h。

本研究所采用的野生型煙草（Nicotianatabacum cv.Xanth）種子均由本實(shí)驗(yàn)室所繁殖。煙草種子先用按1：200比例稀釋的農(nóng)藥（medience-sporetexnase）浸泡24h殺滅真菌，再加入2mL1% SDS與5% NaClO的混合液進(jìn)行消毒處理，播種于MS培養(yǎng)基上。

1.2引物合成

根據(jù)丹波黑大豆SSH cDNA文庫(kù)測(cè)序所得的GmbHLH30 EST片段，在大豆數(shù)據(jù)庫(kù)中查找bHLH基因全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)引物，在5'一端引物加BamH I酶切位點(diǎn)，3'-端引物加X(jué)ho I酶切位點(diǎn)，引物序列如下：基因全長(zhǎng)克隆引物：GmbHLH30 5/：5/-GGATCCATGATACAGGAA-GATCAAGG-3/（BamH I），GmbHLH30 3'：5'-CTCGAGAAGACCTCGATC-CGTTCC-3'（Xho I）；表達(dá)譜引物：GmbHLH30 5'：5'-GGATCCATGATACACJGAA-GATCAAGG-3'，GmbHLH30 3'：5'-GTCCAACAAGGGATTCAGA-TA-3'。

1.3GmbHLH30基因的獲得

使用TRIzol@Reagent（Invitrogen）提取植物總RNA，并將RNA純化，然后使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。采用TIANGEN公司Taq DNApolymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增GmbHLH30基因，再用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收GmbHLH30基因片段，并使用pMD18-T vector kit （TaKaRa）進(jìn)行TA克??；然后用熱刺激法轉(zhuǎn)化E.coli DH5α；最后采用藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆。

1.4轉(zhuǎn)基因煙草根伸長(zhǎng)的測(cè)定

分別取具有4～6條幼根的野生型煙草（WT）、GmbHLH30-10和GmbHLH30-20煙草無(wú)菌苗各4株，水培3d后，用0.5mmol/L、pH4.5的CaCl2溶液預(yù)處理12h后測(cè)定每株幼苗的根長(zhǎng)。然后置入50μmol/L pH4.5的AlCl3（含0.5mmol/L CaCl2）溶液處理24h后再次測(cè)定其根長(zhǎng)。相對(duì)根伸長(zhǎng)率=（AlCl3處理后根長(zhǎng)-AlCl3處理前根長(zhǎng)）/CK根伸長(zhǎng)。

1.5煙草植株中可溶性糖、脯氨酸和過(guò)氧化氫含量測(cè)定

分別取生根后1個(gè)月左右的WT、Gmb-HLH30-10和GmbHLH30-20煙草無(wú)菌苗各3株，置入0.5mmol/L pH4.5的CaCl2溶液預(yù)處理12h，再放人50μmol/L pH4.5的AlCl3（含0.5mmol/LCaCl2）溶液中處理24h，用于測(cè)定可溶性糖、脯氨酸（Pro）和過(guò)氧化氫（H2O2）含量。

采用蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖含量，以μmol·g-1 FW表示。測(cè)定OD625值后代入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0345x+0.0204計(jì)算可溶性糖含量。

采用磺基水楊酸法測(cè)定脯氨酸含量，以μmol·g-1 FW表示.測(cè)定OD520值后代入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0223x-0.0286后計(jì)算脯氨酸含量。

過(guò)氧化氫（H2O2）含量采用二甲酚橙法進(jìn)行測(cè)定，以μmol.g-1 FW表示。

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有生理生化指標(biāo)測(cè)定至少設(shè)置3次重復(fù)，用TEST法對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和差異顯著性分析。星號(hào)表示50μmol/L AlCl3脅迫處理24h后轉(zhuǎn)基因株系和WT株系間生理指標(biāo)間存在顯著性差異（*表示P<0.05，**表示P

2研究結(jié)果

2.1不同鋁處理時(shí)間黑豆根中bHLH30基因表達(dá)譜分析

用50μmol/L AlCl3處理丹波黑大豆和云南小黑豆，處理時(shí)間為0、2、4、8、12、24h，然后以大豆28S rRNA作為內(nèi)參，分別對(duì)這兩種豆根進(jìn)行RT-PCR分析bHLH30的表達(dá)水平。結(jié)果顯示云南小黑豆處理2h時(shí)bHLH30表達(dá)量突然上升，4h又下降，8h表達(dá)量達(dá)到最大，隨后表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（圖1）。而丹波黑大豆根中bHLH30的表達(dá)量開(kāi)始隨著處理時(shí)間的增加而增加，當(dāng)達(dá)到8h時(shí)，丹波黑大豆bHLH30的表達(dá)量達(dá)到最大值，之后隨著處理時(shí)間的增加其表達(dá)量逐漸下降（圖1）。這表明黑豆根中bHLH30的表達(dá)受鋁脅迫的誘導(dǎo)。

2.2GmbHLH30過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草的篩選與鑒定

通過(guò)Gatewav技術(shù)將GmbHLH30基因亞克隆到植物表達(dá)載體pK2GW7中構(gòu)建植物表達(dá)載體pK2-35S-GmbHLH30，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草。在基因組水平（圖2A）、RNA水平（圖2B）和蛋白水平（圖2C）上對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行鑒定。在基因組水平檢測(cè)時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系GmbHLH30-9、GmbHLH30-10、GmbHLH30-11、GmbHLH30-13、GmbHLH30-20等植株中均檢測(cè)出了GmbHLH30基因。在這些植株中，選取GmbHLH30-10與GmbHLH30-20株系進(jìn)行RNA水平與蛋白水平的檢測(cè)，結(jié)果表明GmbHLH30基因成功轉(zhuǎn)入煙草并能夠在轉(zhuǎn)基因煙草中成功表達(dá)。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中均選取GmbHLH30-10與GmbHLH30-20株系作為研究對(duì)象。

2.3GmbHLH30過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草的抗鋁生理特性分析

在鋁脅迫下，鋁對(duì)植物根部的毒害最明顯。為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)鋁是否具有耐受性，我們對(duì)其根相對(duì)伸長(zhǎng)率進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明在50μmol/LAlCl3脅迫處理24h后，轉(zhuǎn)GmbHLH30基因煙草的相對(duì)根伸長(zhǎng)率比野生型大，其相對(duì)根伸長(zhǎng)率比野生型大1.75～2倍（圖3A）。這說(shuō)明轉(zhuǎn)基因植株對(duì)鋁的耐受性比野生型植株強(qiáng)。

轉(zhuǎn)GmbHLH30基因煙草可溶性糖、脯氨酸含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3B、C。結(jié)果表明50μmol/L AlCl3脅迫處理24h后轉(zhuǎn)GmbHLH30基因煙草根和葉中可溶性糖含量都比野生型的高，其中葉中的可溶性糖含量顯著增加，而脯氨酸含量在轉(zhuǎn)GmbHLH30基因的植物根中比野生型的低，葉片中則顯著增加。這說(shuō)明鋁脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草通過(guò)調(diào)節(jié)可溶性糖、脯氨酸含量的變化來(lái)維持植物體內(nèi)滲透壓的穩(wěn)態(tài)來(lái)提高轉(zhuǎn)GmbHLH30基因煙草的耐鋁能力。

在鋁脅迫下，通常會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)產(chǎn)生氧化損傷。通過(guò)測(cè)定植株體內(nèi)H2O2含量水平來(lái)反映出轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株中氧化損傷水平差異。野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草根和葉中H2O2含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3D。研究結(jié)果顯示與野生型相比，50μmol/L AlCl3脅迫處理24h后轉(zhuǎn)GmbHLH30基因煙草根和葉中H2O2含量均下降且維持較低水平。說(shuō)明轉(zhuǎn)基因煙草在鋁脅迫下能夠存一定程度上清除體內(nèi)的H2O2，降低氧化損傷的程度，最終提高自身的耐鋁能力。

3討論

前期研究已證明丹波黑大豆的耐鋁能力比云南小黑豆強(qiáng)。本研究中，用50μmol/l，的AlCl3處理丹波黑大豆（RB）和云南小黑豆（SB）后對(duì)其表達(dá)譜進(jìn)行分析。研究結(jié)果表明Al脅迫處理丹波黑大豆0到8h，bHLH基因表達(dá)水平逐漸增強(qiáng)，8h達(dá)到最大值，隨后表達(dá)逐漸減弱。云南小黑豆在2h表達(dá)量上升，4h下降，到8h達(dá)到最大值，之后逐漸減弱（圖1）。這可能是由于云南小黑豆對(duì)鋁脅迫的耐受性較弱，對(duì)鋁的外部耐受機(jī)制也比丹波黑大豆弱。因此在2h處理時(shí)，主要依靠誘導(dǎo)內(nèi)部耐受機(jī)制抵御鋁毒，隨著鋁脅迫時(shí)間的增加，已表達(dá)的GmbHLH30轉(zhuǎn)錄因子會(huì)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá).在一定程度上增強(qiáng)植株的耐鋁能力，使植株對(duì)鋁毒的敏感性稍微減弱，所以云南小黑豆處理4h，GmbHLH30的表達(dá)量減少。處理8h，云南小黑豆中的GmbHLH30的表達(dá)水平較丹波黑大豆中的表達(dá)水平高。由于丹波黑大豆的耐鋁能力相對(duì)較強(qiáng)，其外部耐受機(jī)制可能也較強(qiáng)，所以，在0～8h的處理過(guò)程中，GmbHLH30的表達(dá)量是逐步增加的。在處理時(shí)間為8h時(shí)，兩種豆中GmbHLH30的表達(dá)量都達(dá)到最大值。但是，隨后的12～24h之間，GmbHLH30的表達(dá)量都降低。這可能是由于植株可以在一定程度上通過(guò)內(nèi)部耐受機(jī)制和外部耐受機(jī)制抵抗鋁的毒害作用，超過(guò)一定的范圍后，鋁的毒害作用會(huì)對(duì)植株造成損傷，影響植株正常的新陳的代謝、生理生化過(guò)程。從而導(dǎo)致植株整體機(jī)能下降，使得處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，GmbHLH30轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量會(huì)下降。

由于植物的根與土壤中的鋁直接接觸，在鋁脅迫下，鋁的毒害作用對(duì)植物根部的影響較明顯。本研究結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植物的根相對(duì)伸長(zhǎng)率比野生型煙草的大（圖3A），說(shuō)明轉(zhuǎn)基因植物具有抵抗鋁的毒害作用，使根部不受損傷，具有較大的相對(duì)根伸長(zhǎng)率；而野生型煙草對(duì)鋁毒害作用較敏感，根的生長(zhǎng)受到抑制。有文獻(xiàn)報(bào)道，用鋁處理大麥8h后，根尖細(xì)胞中的DNA會(huì)發(fā)生斷裂，并且還會(huì)形成凋亡體，使細(xì)胞發(fā)生凋亡。由于細(xì)胞死亡，從而抑制根的生長(zhǎng)。

在各種逆境脅迫下，植物細(xì)胞通過(guò)主動(dòng)積累各種有機(jī)和無(wú)機(jī)物質(zhì)來(lái)提高細(xì)胞液濃度，維持膨壓，保護(hù)質(zhì)膜的穩(wěn)定，從而維持原有的生理過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Al脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因炯草和野生型煙草的生理特性有顯著不同的影響。鋁脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草根中可溶性糖和脯氨酸的含量都較低，而在葉中的含量比野生型煙草顯著的增加（圖3B、C），這說(shuō)明在鋁脅迫下轉(zhuǎn)基因植物根受到的危害比較少，具有鋁毒抗性。轉(zhuǎn)基因植物葉片上累積較多的可溶性糖和脯氨酸，由于這兩種物質(zhì)都是滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可降低溶質(zhì)勢(shì)，保持較高的膨壓，維持植物的正常生長(zhǎng)，同時(shí)這兩種物質(zhì)有利于轉(zhuǎn)基因煙草清除體內(nèi)的過(guò)氧化物質(zhì)，從而提高轉(zhuǎn)基因植物耐鋁毒性。從H2O2含量的生理期指標(biāo)來(lái)看，轉(zhuǎn)基因煙草的根和葉中含量都維持較低水平（圖3D），這說(shuō)明轉(zhuǎn)基因煙草的根部受A1脅迫危害比較少，植物能夠正常生長(zhǎng)。

綜上所述，鋁脅迫下轉(zhuǎn)GmbHLH30基因煙草通過(guò)累積滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可溶性糖和脯氨酸來(lái)維持植物體內(nèi)滲透壓的穩(wěn)態(tài)，低的H2O2水平以減少氧化損傷來(lái)抵御銷脅迫，提高轉(zhuǎn)GmbHLH30基因煙草的耐鋁能力。在鋁脅迫下，促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因煙草bHLH轉(zhuǎn)錄因子的過(guò)量表達(dá)，可能通過(guò)轉(zhuǎn)錄凋控可溶性糖和脯氨酸等調(diào)節(jié)滲透物質(zhì)的代謝合成和累積以及清除自由氧基相關(guān)的靶基因，使煙草葉中含有較高的可溶性糖和脯氨酸含量以及較低的H2O2含量，維持植物膨壓和保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，達(dá)到減輕Al對(duì)細(xì)胞的毒害，從而使植物在一定程度上忍受、減緩或抵抗逆境脅迫。bHLH轉(zhuǎn)錄因子具體調(diào)控哪些靶基因還有待進(jìn)一步研究。