張學(xué)梅 趙彩紅 李俊 羅曉 蔣葵

摘要：鼠源抗人乳腺癌多藥耐藥相關(guān)蛋白1（multidrug resistance-associated protein l，MRPl/ABCCl）噬菌體Fab抗體庫的構(gòu)建首先是利用乳腺癌組織勻漿液作為免疫原免疫BALB/e小鼠，成功免疫后提取小鼠脾組織的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后設(shè)計(jì)小鼠IgG各亞型的特異性Fab引物，PCR擴(kuò)增Fd和L基因并依次連接到噬菌體載體pComb3中。重組體pComb3-Fab轉(zhuǎn)化至E.coli XLl-Blue菌中，最后經(jīng)輔助噬菌體VCSM13超感染.成功構(gòu)建噬菌體Fab抗體庫。以化學(xué)合成的MRPl/ABCC1膜表位10肽為抗原進(jìn)行3輪淘選、富集，對淘選后獲得的各級噬菌體抗體庫進(jìn)行ELISA檢測和鑒定。成功獲得的抗MRPl/ABCCl-10肽三級噬菌體Fab抗體庫將為抗人乳腺癌MRPl/ABCCl Fab抗體的制備提供保障。

關(guān)鍵詞：Fab抗體；多藥耐藥相關(guān)蛋白1 （MRPl/ABCCl）；乳腺癌

中圖分類號：R392.12

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號：1007-7847（2014）04-0338-06

乳腺癌是世界范圍內(nèi)危害女性健康的惡性腫瘤之一。國內(nèi)婦女乳腺癌的發(fā)病率比世界其他國家低，但最近的調(diào)查顯示，其正呈逐年上升的趨勢。化學(xué)療法作為治療腫瘤的經(jīng)典方法之一，臨床上被廣泛應(yīng)用于乳腺癌的治療。然而，多藥耐藥的發(fā)生往往導(dǎo)致臨床上絕大多數(shù)乳腺癌患者化療失敗。MRPl/ABCCl （multidrug resistance-as-sociated protein l，MRPl/ABCCl）是一種被認(rèn)為和乳腺癌患者多藥耐藥發(fā)生密切相關(guān)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。Taheri等研究發(fā)現(xiàn)，相對于正常的乳腺組織，MRPl/ABCC1在乳腺癌腫瘤組織中的含量明顯增高。Rudas等研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者接受化療后腫瘤組織MRPl/ABCC1的含量明顯高于化療前腫瘤組織MRPI/ABCC1的含量。另外，韓曄等在研究MRPl/ABCC1在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移乳腺癌組織中的表達(dá)與乳腺癌的侵襲、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)。MRPl/ABCCl在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中高表達(dá)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)。可見，加強(qiáng)對MRPl/ABCC1的檢測，對乳腺癌多藥耐藥的監(jiān)測至關(guān)重要。目前用于檢測MRPl/ABCC1的特異性抗體幾乎均為完整的單克隆抗體。完整的單克隆抗體相對分子質(zhì)量大、組織穿透力弱，在MRPl/ABCCl的檢測中具有局限性。本研究通過構(gòu)建鼠源抗人乳腺癌MRPl/ABCC1噬菌體展示Fab抗體庫，為進(jìn)一步制備抗MRPl/ABCC1的小分子抗體（Fab抗體）提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑

TRlzol Reagent購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、T4 DNA連接酶試劑盒、氨芐青霉素（Amp）、四環(huán)素（Tet）、卡那霉素（Kan）購自北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司；X-Gal、IPTG、Spe I、Xho I、Sac I和 Xba I購自寶生物工程（大連）有限公司；LB培養(yǎng)基購自美國BD公州；PEG8000購自美國Amresco公司；MRPl/ABCCl-10肽（DPIVNGTQEH）由上海強(qiáng)耀生物科技有限公司合成。ALP標(biāo)記馬抗小鼠IgG抗體購自美國Vector Laboratories公司；抗噬菌體蛋白Ⅲ抗體購自美國Abcam公司。

1.1.2動(dòng)物

BALB/c小鼠購自大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心。

1.1.3載體、宿主菌與輔助噬菌體

E.coli XLl-Blue菌種、E.coli Topl0菌種，噬菌粒載體pComb3均由大連大學(xué)醫(yī)學(xué)研究中心分子藥理實(shí)驗(yàn)室保存。T載體購自寶生物工程（大連）有限公司。輔助噬菌體VCSM13購自美國Agilent公司。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物免疫

將15例耐藥大腸癌病理組織等量混合，加入適量滅菌生理鹽水，用細(xì)胞勻漿儀制備成勻漿液（50g/L）。勻漿液與等體積弗氏不完全佐劑充分乳化后，用0.22μm微孔濾器過濾除菌即得到抗原液?？乖航?jīng)腹腔注射（0.5mL/10g）8只BALB/c小鼠。分別在初次免疫后14h和30h同樣方法再次免疫BALB/C小鼠。7h后取小鼠血清。ELISA法測定抗體滴度。處死抗體滴度大于1：512的小鼠，留取脾臟組織。

1.2.2引物的設(shè)計(jì)與合成

從IMGT網(wǎng)站檢索小鼠IgG各亞型（IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3）重鏈基因序列及輕鏈基因序列（K鏈和λ鏈）。利用Multalin在線比對軟件分析重鏈FR1區(qū)及鉸鏈區(qū)基因序列，設(shè)計(jì)重鏈Fd引物：5條上游引物：HBl：GCGCTCGAGCAGKTCCAGCTGAAGCAGTC；HB2：GCCCTCGAGCAGGTTCARCTGCARCAGTC；HB3：GCGCTCGAGCAGGTGCAGCTGAAGSAGTC；HB4：GCGCTCGAGGAAGTGMWGCTGGTGGAGTC；HB5：GCGCTCGAGGAAGTGAARMTTGAGGAGTC；和1條下游引物：HF1：GCGACTAGTGCATTTGCATGGAGGACAG；同時(shí)利用該軟件分析輕鏈FR1區(qū)及恒定區(qū)基因序列，設(shè)計(jì)輕鏈L引物：5條上游引物：LBl：GCGGAGCTCGATRTTGTGATGACCCARAC；LB2：GCGGAGCTCGATGTTGTKSTGACYCAAAC；LB3：GCGGAGCTCGAAAWTGTKCTCACCCAGTC；LB4：GCGGAGCTCGATATCCAGATGACACAGAC；LB5：GCGGAGCTCCAGGCTGTTGTGACTCAGGA-ATC；和2條下游引物：LFl：GCGTCTAGACTCATTCCTGTTGAAGCTCT；LF2：GCGTCTAGAGGACAAACTCTTCTCCACAG）。其中Y=C，T； W=A，T； M=A，C；R=A，G；K=G，T；S=G，C。引物由南京金斯瑞生物科技公司合成。

1.2.3組織總RNA的提取和cDNA的獲得

分別取100mg不同小鼠脾臟組織于研缽中，迅速加入液氮，研成粉末。加入TRIzol Reagent提取總RNA。紫外分光光度儀定量，瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。然后按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明獲得cDNA。

1.2.4PCR擴(kuò)增重鏈Fd段基因及輕鏈L基因

反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min， 95℃變性30s，95℃退火30s，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，按DNA凝膠回收試劑盒說明回收。

1.2.5輕鏈L基因與pComb3載體重組

輕鏈L基因經(jīng)Xba I和Sac I雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收并定量。T載體和回收后的輕鏈L基因，經(jīng)T4 DNA連接酶連接，將連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化至E.coli Topl0感受態(tài)細(xì)胞，并涂布LB/Amp/X-Gal/IPTG平板，37℃過夜培養(yǎng)。統(tǒng)計(jì)藍(lán)、白斑數(shù)，并計(jì)算重組率。重組率=（白色菌落數(shù)/（藍(lán)色菌落數(shù)+白色菌落數(shù)）×100%）。反復(fù)幾次上述步驟，最終使白斑數(shù)達(dá)到1.0xl05以上，即得T-L庫。提取T-L庫質(zhì)粒。分別將pComb3載體和T-L庫質(zhì)粒經(jīng)Xba I和Sac I雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收并定量?；厥蘸蟮膒Comb3載體和回收后的輕鏈L基因，經(jīng)T4 DNA連接酶連接，將連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化至E.coli Topl0感受態(tài)細(xì)胞，并涂布LB/Amp/Tet平板，37℃過夜培養(yǎng)，計(jì)算總菌落數(shù)。用LB液體培養(yǎng)基刮取平板上菌落，加入終濃度至10%的甘油，-80℃保存。反復(fù)幾次上述步驟，最終使pComb3-L克隆數(shù)達(dá)到1.Ox105以上，即得pComb3-L庫。提取pComb3-L庫質(zhì)粒。

1.2.6重鏈Fd基因與pComb3-L載體重組

分別將pComb3-1庫質(zhì)粒和重鏈Fd基因經(jīng)Xho I和Spe I雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收并定量?；厥蘸蟮膒Comb3-L質(zhì)粒和回收后的重鏈Fd基因，經(jīng)DNA連接酶連接，將連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化至E.coli XLl-blue感受態(tài)細(xì)胞，并涂布LB/Amp/Tet平板，37℃過夜培養(yǎng)，計(jì)算總菌落數(shù)。用LB液體培養(yǎng)基刮取平板上菌落，加入終濃度至10%的甘油，-80℃保存。反復(fù)幾次上述步驟，最終使pComb3-L-Fd克隆數(shù)達(dá)到1.0×l05以上，即得Fab抗體庫。隨機(jī)挑取10個(gè)單克隆，并提取質(zhì)粒。各質(zhì)粒分別經(jīng)Xho I/Spe I、Xba I/Sac I雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，計(jì)算Fab抗體庫Fab基因插入率。

1.2.7抗人乳腺癌噬菌體Fab抗體庫的擴(kuò)增

取5mL抗人乳腺癌Fab抗體庫接種于50mL LB/Amp/Tet液體培養(yǎng)基中，37℃、220r/min振蕩培養(yǎng)4h （OD600nm≈0.4）。然后加入40μL滴度為1.19xl014pfu/μL的輔助噬菌體VCSM13，37℃、110r/min培養(yǎng)1.5h。加入50μL卡那霉素（80g/L），37℃、280r/min過夜培養(yǎng)。過夜培養(yǎng)菌液轉(zhuǎn)入50mL無菌離心管，4℃、8000r/min離心30min。上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中，然后添加2gPEG8000和1.5gNaCl，混勻至溶質(zhì)充分溶解，冰水中放置1.5h。4℃、8000r/min離心30min，棄上清，用2mL含l% BSA的TBS溶解沉淀。4℃、8000r/min離心5min，收集上清液，即擴(kuò)增后的噬菌體Fab抗體庫。取10μL噬菌體抗體庫做不同梯度（10-1～l0-12）稀釋，各稀釋度噬菌體與XLl-Blue菌液（OD600nm≈0.4）按1：10混勻，37℃水浴30min。分別取10μL各梯度混合液涂布LB/Amp/Tet固體培養(yǎng)基，37℃過夜孵育。次日，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，計(jì)算擴(kuò)增后的噬菌體抗體庫滴度。

1.2.8抗人乳腺癌MRPl/ABCCl Fab抗體庫的淘選和富集

用MRPl/ABCCl-10肽（每孔25μg）包被ELISA板孔，4℃過夜；3% BSA滿孔封閉，4℃過夜；每孔加入噬菌體Fab抗體庫80μL，37℃孵育2h。TBST（每孔 350μL）清洗ELISA板孔1次（第2輪為5次、第3輪為15次），拍干。每孔加入80μL洗脫液，10min內(nèi)反復(fù)吹打3次，立即加入10μL中和液，混勻。將混合液立即加到2mL的XLl-Blue菌液（OD600nm≈0.4）中，37℃水浴30min。取10μL菌液做不同梯度稀釋并涂布LB/Amp/Tet固體培養(yǎng)基，37℃過夜孵育。次日，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)基上的菌落數(shù)并計(jì)算每輪淘選后噬菌體的滴度。剩余菌液加入到50mL無菌的LB/Amp/Tet液體培養(yǎng)基中，按1.2.7中步驟擴(kuò)增并收集過夜培養(yǎng)液中的噬菌體，即抗人乳腺癌MRPl/ABCCl-10肽一級庫。取10μL噬菌體抗體庫做不同梯度稀釋并與E.coli XLl-Blue菌液（OD600nm≈0.4）按1：10混勻，37℃水浴30min。將各梯度混合液涂布LB/Amp/Tet固體培養(yǎng)基，37℃過夜孵育。統(tǒng)計(jì)總菌落數(shù)，計(jì)算每輪經(jīng)淘選擴(kuò)增后的噬菌體滴度。然后，將抗人乳腺癌MRPl/ABCCl一級庫進(jìn)行第2輪到第3輪淘選，計(jì)算每一輪淘選產(chǎn)出率。

1.2.9抗人乳腺癌MRPl/ABCCl-1O肽Fab各級庫的ELISA鑒定

取用MRPl/ABCCI-1O肽（25μg/孔）包被的ELISA板孔，各孔分別加入80λL空白對照（TB-ST）、陰性對照（VCSM13）、各級抗MRPl/ABCCl-10肽Fab抗體庫，37℃孵育3h。均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。用TBST清洗ELISA板孔15次，拍干。然后加入1：3000稀釋的ALP標(biāo)記的馬抗小鼠IgG抗體，37℃孵育3h。TBST清洗ELISA板15次，拍干。每孔加入l00μL PNPP顯色液，避光顯色30min后加入10μL H2SO4（2mol/L）終止反應(yīng)，BIORADModel 550酶標(biāo)儀讀值A(chǔ)405nm。

2結(jié)果

2.1組織總RNA的提取

經(jīng)紫外分光光度儀測定，總RNA的濃度為9.64g/L，A260nm/A280nm=2.03。完整性良好（圖1）。

2.2重鏈Fd和輕鏈L基因的擴(kuò)增

以鼠源cDNA為模板，擴(kuò)增重鏈Fd和輕鏈L基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳并成像，在重鏈Fd基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖中，650bp左右處可見基因片段（圖2）；在輕鏈L基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖中，650bp左右處可見基因片段（圖3）

2.3Fab抗體庫的構(gòu)建

輕鏈L基因與T載體重組，平板上可見大量白色菌落和少量藍(lán)色菌落，所有平板重組率均大于95%。白色菌落總數(shù)為1.03x105cfu。輕鏈L基因與pComb3載體重組，pComb3-L庫容量為l.25xl05cfu。重鏈Fd基因與pComb3-L載體重組，F(xiàn)ab庫容量為1.49×105cfu。將Fab抗體庫混勻后，分區(qū)劃線接種，隨機(jī)挑取10個(gè)單克隆，提取質(zhì)粒。經(jīng)Xho I和Spe I雙酶切，在650bp左右處可見基因片段，插入率為90%；同時(shí)經(jīng)Xba I和Sac I雙酶切，在650bp左右處可見基因片段，插入率為90%（圖4）。Fah抗體庫Fab基因插入率為81%，有效庫容為1.21xl05。

2.4抗人乳腺癌MRPl/ABCCl-10肽Fab抗體庫富集、淘選結(jié)果

鼠源抗人乳腺癌Fab抗體庫經(jīng)輔助噬菌體VCSM13感染后，以MRPI/ABCCl-10肽為抗原對噬菌體抗體庫進(jìn)行3輪“吸附一洗脫一擴(kuò)增”，結(jié)果顯示第二輪產(chǎn)出率最高，說明第二輪時(shí)與MRPl/ABCCl-10肽結(jié)合的噬菌體已得到最佳富集（表1）。

2.5抗人乳腺癌MRPl/ABCCl-10肽Fab各級庫的ELISA鑒定

對以MRPI/ABCCl-10肽為抗原淘選所獲得的各級文庫進(jìn)行FLISA鑒定。與陰性對照比較，各級Fab抗體庫的A405nm值均顯著高于陰性對照（P<0.05）。由此證明經(jīng)過三輪淘選，所獲得的各級庫均具有和MRPl/ABCCl-10肽結(jié)合的能力，其中三級噬菌體抗體庫結(jié)合能力最強(qiáng)（圖5）。

3討論

免疫抗體庫是指從經(jīng)特定抗原免疫后的個(gè)體上獲取特異性抗體基因信息，以此為模板構(gòu)建得到的抗體庫。本研究用人乳腺癌組織勻漿液免疫小鼠，從免疫后的小鼠脾組織中獲取與乳腺癌相關(guān)的抗體信息。因經(jīng)過抗原刺激，免疫后的抗體在機(jī)體內(nèi)經(jīng)歷了自然選擇和親和力成熟過程，從所構(gòu)建的免疫抗體庫中篩選到特異性強(qiáng)、親和力高的抗體得率明顯提高。

目前，噬菌體抗體庫技術(shù)已被廣泛用于單克隆抗體的研究。Tohidkia等認(rèn)為抗體庫的庫容量和多樣性決定了抗體庫的有效性，直接影響到高特異性、高親和力抗體的獲得。為保證所構(gòu)建的鼠源抗人乳腺癌MRPl/ABCC1噬菌體Fab抗體庫具有庫容量大和多樣性等特點(diǎn)。本研究采取了以下措施：1）小鼠經(jīng)人乳腺癌組織勻漿液免疫后，取抗體滴度大于1：512的小鼠脾細(xì)胞提取總RNA，從基因來源方而保證抗乳腺癌抗體基因的豐度；2）為確保通過PCR技術(shù)擴(kuò)增得到的Fab抗體基因信息的多樣性，本研究從1MGT網(wǎng)站檢索小鼠IgG重鏈和輕鏈基因序列（K鏈和λ鏈），共設(shè)計(jì)重鏈Fd段引物5對，輕鏈L引物10對。設(shè)計(jì)引物所依據(jù)的模板包括小鼠IgG各個(gè)亞型（IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG2c、lgG3）；3）針對實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)的輕鏈L與pComb3載體連接效率低這一問題，本研究采用先將輕鏈L與T載體連接，在T-L有效庫容量超過lxl05以上后，通過酶切回收獲得大量輕鏈L基因，然后再將輕鏈L克隆到pComb3載體中；4）優(yōu)化連接體系，保證重組子的轉(zhuǎn)化效率；5）為保證抗體庫的有效庫容量，本研究采用多批次克隆的方式。如，每次連接轉(zhuǎn)化后，均隨機(jī)挑取單克隆酶切鑒定插入率，以轉(zhuǎn)化效率最高的條件，進(jìn)行下一批基因克隆。

MRPl/ABCCI-10肽是MRPl/ABCC1位于細(xì)胞膜外的一個(gè)線性抗原表位。從構(gòu)建的鼠源抗人乳腺癌Fab抗體庫中利用噬菌體展示技術(shù)篩選抗MRPl/ABCCl-10肽的Fab抗體，在得到Fab抗體表型信息的同時(shí)也將獲得其基因信息。由于通過基因工程技術(shù)獲得的小分子抗體具有相對分子質(zhì)量小、組織穿透性強(qiáng)、抗原性低等優(yōu)點(diǎn)，抗MRPl/ABCCl-10肽Fab抗體的獲得，可用于研究人乳腺癌MRPl/ABCC1膜表位的功能，從細(xì)胞乃至分子水平尋找乳腺癌的特異性診斷指標(biāo)和靶向治療位點(diǎn)。另外，經(jīng)標(biāo)記的Fab抗體可用于免疫組化和流式細(xì)胞術(shù)，以檢測和計(jì)數(shù)過表達(dá)MRPI/ABCCI的腫瘤細(xì)胞，為乳腺癌多藥耐藥的監(jiān)測提供依據(jù)。