陳鴻鵬　朱鳳云　謝耀堅

摘 要 微管蛋白是真核生物中普遍存在的結構蛋白，在細胞的形態(tài)維持、分裂、遷移以及信號轉導等方面發(fā)揮著重要的作用，同時也是熒光定量PCR技術中常見的一種內參基因。為深入了解α-微管蛋白（α-tubulin）對桉樹生長發(fā)育的調節(jié)，本研究根據α-Tubulin基因的保守區(qū)段設計簡并引物，從赤桉嫩葉中獲得了3條tubulin基因的片段，并利用RACE技術得到了這些基因的全長cDNA，將其命名為EC-TUB1、EC-TUB2和EC-TUB3基因。此外，通過網上資源和生物信息學軟件對這3條基因進行分析，發(fā)現(xiàn)這些基因編碼的蛋白具有α-Tubulin蛋白特有的保守序列和活性結構域的相關特征，同時與其他植物的α-Tubulin蛋白具有較高的相似性，這為了解α-tubulin在桉樹生長發(fā)育過程中的表達特性以及α-tubulin蛋白的功能，進一步揭示和利用桉樹生長發(fā)育機理和樹種間的差異性奠定了理論基礎。

關鍵詞 赤桉；α-tubulin；家族基因；克?。簧镄畔W分析

中圖分類號 Q753；S722.33 文獻標識碼 A

微管蛋白（Tubulin，TUB）最初是在精子鞭毛中發(fā)現(xiàn)的一種細胞骨架蛋白，是微管的主要化學成分，可以分為α、β、γ、δ、ε等多種微管蛋白，其中，α、β和γ是主要的微管蛋白[1-4]。α和β微管蛋白屬于球形蛋白，是構成微管的基本組成單位。α/β微管蛋白的二聚體與GTP結合后，分布于微管的兩端，β微管蛋白在頭部，α微管蛋白在尾部。此外，α微管蛋白在人類神經元的形成中起著重要的作用[5]，同時對于植物抵抗外界真菌侵入有一定作用[6]。研究表明，α微管蛋白基因在玉米敗育前的相對表達量大于敗育后的相對轉錄量，轉錄量證明了α微管蛋白在花粉發(fā)育中起著重要作用，對玉米的雄性不育性密切相關[7]。β微管蛋白在動物中神經信號的傳導和植物中的信號傳遞起著重要的作用[8]。李園莉等研究發(fā)現(xiàn)，棉花的TUB基因主要在纖維細胞中表達，在細胞快速延伸階段表達量較高，在伸長速度最快時達到了高峰，并在酵母中大量的表達能使其細胞顯著伸長或產生分支，暗示該基因的表達可能與纖維細胞的極性生長相關[9]。由于α微管蛋白和β微管蛋白的廣泛分布，其編碼基因還是常見的內參基因，在實時熒光定量PCR技術中有著廣泛的應用[10]。γ微管蛋白在真核生物體內行使著重要的細胞功能，它起始于胞內微管的晶核形成，控制著有絲分裂中紡錘體的復制等，并進而影響微管以及其他細胞結構的生物功能[11-12]，同時也對α/β微管蛋白形成微管具有一定的調控作用[13]。

赤桉（Eucalyptus camaldulensis）是桉樹（Eucalypts）屬桃金娘科（Myrtaceae）的一個樹種，具有生長快，適應性強，喜光，耐高溫、干旱、耐堿等特性，因此在桉樹的育種與栽培等領域中有著廣泛的應用[14-15]。微管蛋白作為細胞骨架蛋白，對植物的生長極為重要。因此，為了了解微管蛋白基因的特點對赤桉的生長影響，本研究采用RACE和RT-PCR方法克隆了赤桉中的α-tubulin家族的3條基因，并利用生物信息學方法對這些基因進行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 本研究所用的赤桉幼苗栽種于國家林業(yè)局桉樹研究開發(fā)中心國家南方種苗基地，將赤桉的嫩葉采摘后，立即于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 感受態(tài)細胞為大腸桿菌DH5α、dNTPs、DNase、DNA凝膠回收試劑盒等購自Ambio公司；cDNA Synthesis Kit購自Thermo公司；Prime-star高保真酶購自Takara公司； 100 bp plus DNA Ladder、DNase、Total RNA Purification System、5′RACE以及3′RACE試劑盒等購自Invitrogen公司；pEASY-Blunt Simple載體購自北京全式金公司；其它生化試劑和常規(guī)試劑如DEPC、H2O、Tris、EDTA、無水乙醇、EB、巰基乙醇等均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 生物信息學軟件以及網上資源 GENDOC、Chromas、Vector NI 11.0、GeneTree、Anthprot 5.0、VMD 1.8.5以及Primer Premier 5.0等生物信息學軟件，GenBank，SoftBerry，ExPASy-ProtParam tool以及Swissmodel等網上資源。

1.2 方法

1.2.1 赤桉葉片總RNA提取與cDNA合成 將液氮保存的赤桉嫩葉迅速取出，在液氮中研磨成粉末狀，參照Invitrogen公司提供的試劑盒進行總RNA的提取，電泳檢測，之后用相應的試劑盒將總RNA反轉錄成cDNA、5′RACE cDNA和3′RACE cDNA，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 TUB基因保守區(qū)片段的克隆 TUB蛋白是一種在進化上比較保守的蛋白，尤其是功能性區(qū)域，通過對NCBI數據庫中TUB蛋白的序列分析和比對，發(fā)現(xiàn)TUB蛋白最保守區(qū)的序列為：DKTV

GGGDDAFNTFFSETGAGKHVPRA，SMMAKCDPRH

GKYMACCLMYRGDVVPKDVNAAV，由此設計了如下引物進行保守區(qū)的擴增：

EC-TUB F1：5′-GATAAAACCGTGGGCGGCG

GCGATGA-3′

EC-TUB R1：5′-CGTTCACATCTTTCGGCACC

ACA-3′

以赤桉嫩葉cDNA為模板，選用EC-TUB F1& EC-TUB R1引物進行PCR擴增。50 μL PCR反應體系：0.5 μL PrimeStar聚合酶（5 U/μL），5.0 μL 10×PCR buffer（with Mg2+），4.0 μL dNTPs（各2.5 mmol/L），2.0 μL cDNA，1.0 μL EC-TUB F1 （10 μmol/L），1.0 μL EC-TUB R1（10 μmol/L），31.5 μL ddH2O。PCR擴增條件：98 ℃預變性5 min；98 ℃變性10 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，5個循環(huán)；98 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，5個循環(huán)；98 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，25個循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸5 min；4 ℃保溫。反應結束后，對產物進行回收、克隆和測序。

1.2.3 TUB基因RACE片段的克隆 通過對獲得基因片段進行克隆測序，利用Primer Premier 6.0分別設計了EC-TUB基因的5′RACE和3′RACE引物（表1），由生物公司合成并通過PAGE方式進行純化。

同理，以赤桉嫩葉5′RACE cDNA為模板，選用5′RACE引物與UPM為引物進行巢式PCR擴增，反應體系同上，用UPM& 5GSP 1/4/7代替EC-TUB F1& EC-TUB R1進行擴增。此后繼續(xù)用5GSP 2/5/8和5GSP 3/6/9做巢式PCR以提高產物純度。

3′RACE反應與5′RACE類似，以3′RACE cDNA為模板，反應體系同上，用AUAP和3GSP 1/3/5和3GSP 2/4/6分別代替UPM和5GSP 1/4/7和5GSP 2/5/8進行巢式PCR擴增。PCR擴增條件：98 ℃預變性5 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸5 min；4 ℃保溫。

對RACE產物分別進行回收、克隆和測序。

1.2.4 TUB基因cDNA編碼區(qū)的克隆 在獲得各個目的基因的全長cDNA序列后，利用Primer Premier 6.0分別設計了各自基因cDNA編碼區(qū)的引物（表2），由生物公司合成并通過PAGE方式進行純化。

同理，以赤桉嫩葉總 cDNA為模板，選用各自的引物進行PCR擴增，反應體系和條件同保守區(qū)片段的擴增，用TUB 1/2/3 F1& TUB 1/2/3 R1代替EC-TUB F1& EC-TUB R1進行擴增，反應結束后，對產物分別進行回收、克隆和測序。

1.2.5 EC-TUB基因的生物信息學分析 在獲知EC-TUB基因保守片段、5′RACE產物和3′RACE產物序列后，將其序列進行拼接，經過比對分析后獲得了EC-TUB基因的全長cDNA，通過網上資源和生物信息學軟件對基因的ORF、功能以及其他特性進行分析和預測。

2 結果與分析

2.1 赤桉嫩葉總RNA的提取質量

取3 μL RNA樣品進行電泳檢測，電泳結束后在凝膠成像系統(tǒng)觀察RNA條帶的清晰度和完整性（圖1）。由圖1可以看出，赤桉嫩葉中所提取的總RNA效果較好，其電泳條帶清晰整齊，無拖尾，而且28 S條帶的亮度約為18 S的2倍，具有較高的純度和完整性，可用于后續(xù)的cDNA反轉錄試驗。

2.2 EC-TUB基因各目的片段的分離

以反轉錄的cDNA為模板，使用EC-TUB F1& EC-TUB R1引物組合進行PCR擴增，得到一條了約900 bp的片段。將此基因片段進行克隆和測序獲得序列信息，經由Vector NTI 11.0和NCBI Blast上進行比對分析后，確認此序列片段是TUB基因的保守區(qū)部分片段。

以5′ RACE cDNA為模板，5′ RACE引物與UPM為引物進行兩輪巢氏PCR擴增后，在1.2%的瓊脂糖凝膠中，100 V電泳40 min，獲得了條帶清晰特異、大小分別為850 bp（圖3A）、500 bp左右的DNA條帶（圖3B）。此外，利用3′ RACE cDNA和相應的引物進行PCR擴增后，通過電泳獲得了830 bp（圖3C）和460 bp左右的產物條帶（圖3D）。最后，根據設計的全長cDNA的ORF引物，也獲得了各個目的基因的ORF片段（圖3E）。

2.4 生物信息學分析

2.4.1 EC-TUB基因的全長cDNA序列分析 將5′ RACE和3′ RACE各片段測序結果去除載體序列部分，并與保守區(qū)部分片段進行拼接后，獲得了3條EC-TUB基因的全長cDNA。此外，通過對3條基因的ORF片段進行克隆和測序后，也與相應的拼接序列信息相符合。通過生物軟件Vector NTI 11.0將測序結果分析，得出3條EC-TUB基因的序列特征（表3），EC-TUB 1與EC-TUB 2和EC-TUB 3只有1個氨基酸序列的差異，而且在C-末端的多變區(qū)，說明這3個EC-TUB的家族基因之間的同源性很高，但是非編碼區(qū)的長度和序列卻有很大差異，可能會具有不同的功能。

2.4.2 EC-TUB基因的蛋白質序列與親緣進化關系分析 應用Vector NTI 11.0將EC-TUB基因的ORF翻譯成蛋白質序列，并與其它不同來源的TUB蛋白進行比對分析，發(fā)現(xiàn)赤桉的3個EC-TUB蛋白與其他物種TUB蛋白同源性較高，高達95%以上，由此可推測這些基因是TUB家族基因（圖4）。TUB蛋白質序列是高度保守的，N-端的MRECI序列為微管蛋白轉錄后調控信號[16-18]，142～148 aa存在1個微管蛋白信號片段GGGTGSG，這個片段是GTP核苷酸結合位點，是α和β兩種分子結合所必須的重要結構[19]，262～392 aa為TubulinC-terminal domain，同時在C-端有1個Tyr，它在序列的酪氨酸化和去酪氨酸化過程中有重要作用[20-21]。此外，C-末端呈強酸性，后40個aa序列有47%為酸性aa，可能是AMP或正離子（如Ca2+）的結合部位[4]。

2.4.3 分子系統(tǒng)進化聚類分析 為探討EC-TUB基因與其他植物同類基因的親緣進化關系，應用ClustalX 2.0和MEGA4.0軟件對該基因編碼的蛋白質與樺樹、葡萄、鷹嘴豆、大豆、棉花等物種的TUB氨基酸序列進行親緣進化關系分析（圖5）。結果顯示，整個進化樹的遺傳距離為0.000～0.180，種間遺傳距離為0.000～0.178；蓖麻、垂枝樺的TUB和EC-TUB 1聚為1個分支，位于系統(tǒng)進化樹的前端；巨桉的TUB和EC-TUB 3聚為1個分支，位于中間；而EC-TUB 2又與巨桉的TUB和EC-TUB 3聚為1個分支，位于靠后的位置。由此說明TUB是一種在進化上非常保守的蛋白，蓖麻、垂枝樺的TUB和EC-TUB 1處于較原始的地位，巨桉的TUB和EC-TUB 3處于中間的位置，而EC-TUB 2是整個進化樹中最進化的1個TUB蛋白。

2.4.4 EC-TUB的理化特性分析 運用生物軟件Antheprot 5.0和ExPASy-ProtParam tool對3個EC-TUB蛋白質序列進行理化性質的分析和預測（表4），發(fā)現(xiàn)3者之間的蛋白質理化性質基本相似，差異很小，都屬于親水性的穩(wěn)定蛋白，在pH7.0的溶液中帶有負電荷。

大量的原核和真核生物的tubulin蛋白同源性很高，序列結構比較相似。從圖6可以看出，3個EC-TUB蛋白都有1個跨膜結構域，它們的位置分別在整個序列的第137～147 aa，138～146 aa，138～146 aa的位置，此結構便于TUB蛋白附著在膜上行使功能[17]。

根據軟件Antheprot 5.0分析，在3個EC-TUB蛋白質序列中，都各自有3個明顯的信號肽剪切位點（圖7），都分別在146、278、389 aa位置上，其中以278 aa位置可能性最大，并且此位點后的肽段為膜外區(qū)，由此推測這些信號肽具有導向作用，可能參與蛋白質的運輸過程，該蛋白經過信號肽引導后結合到膜上，而亞細胞定位預測結果（表5）顯示，EC-TUB主要在細胞質中分布，這與其他物種該基因相關研究結論相符合。

經過Swissmodel Server和VMD1.8.5軟件的分析，發(fā)現(xiàn)在EC-TUB經過多次折疊后，形成了三維立體結構（圖8）[20]。由于3個EC-TUB的蛋白序列高度相似，所以他們的結構也是一樣的。EC-TUB的三維立體結構以α-螺旋和β-片層結構區(qū)為主，有10個α-螺旋11個β-片層結構區(qū)。同時轉錄后調控信號（Met1Arg2Glu3Cys4Ile5）[21]，微管蛋白聚合信號（Gly142Gly143Gly144Thr145Gly146Ser147Gly148）以及酪氨酸活性位點（Tyr408）等幾個調控位點和重要結構出現(xiàn)此立體結構中。

3 討論與結論

本研究從赤桉中得到3個EC-TUB基因的cDNA序列。通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)赤桉的3個EC-TUB蛋白與其他物種TUB蛋白同源性高達95%以上，并且存在典型的微管蛋白轉錄后調控信號和微管蛋白信號片段，3個EC-TUB的理化特性、跨膜結構、亞細胞定位、信號肽剪切位點以及三維立體結構也都具有TUB蛋白的典型特征，因此推測它們可能在桉樹纖維細胞的發(fā)育有很大的相關性，對于桉樹的快速生長有一定的作用。同時，3個EC-TUB的親緣關系遠近不同，推測它們的功能存在一定的差異。

由于這些基因編碼的蛋白質序列高度保守，因此，可以利用RACE結合RT-PCR的方法進行cDNA的克隆。研究表明，大花序桉、巨桉、赤桉尾葉桉、尾巨桉等樹種的纖維形態(tài)差異明顯[24-26]，是否與這些樹種中的TUB基因功能差異有關需要進一步的研究來證實。EC-TUB基因的生物信息學分析為研究該基因在不同樹種或無性系中的表達情況，分離純化該蛋白以及研究其功能等提供了重要的參考依據。同時為進一步作為熒光定量PCR的內參基因分析提供了材料，也為研究其它微管蛋白基因奠定了基礎。

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