汪平　高建明　楊峰　鄭金龍　劉巧蓮　陳河龍　易克賢

摘 要 為克隆劍麻受斑馬紋病病原菌煙草疫霉侵染后的應(yīng)答基因，以病原菌侵染前后的劍麻H.11648葉片為材料，構(gòu)建劍麻轉(zhuǎn)錄組Unigene數(shù)據(jù)庫(kù)；組裝得到非冗余Unigene 131 422個(gè)，其中，500～1 000 bp的Unigene占總數(shù)65.39%，Unigene的數(shù)量隨其長(zhǎng)度遞減。GO分類分析發(fā)現(xiàn)：在得到的所有Unigene中，注釋到生物過程的基因最多（152 835）；細(xì)胞組分其次（129 197）；參與分子功能的最少（47 420）。KEGG代謝通路分析將劍麻轉(zhuǎn)錄組unigene分成128類，其中，參與生化代謝通路的Unigene最多，有9 354個(gè)，占總數(shù)27.09%；參與植物-病原互作代謝通路的基因有1 795個(gè)，占總數(shù)5.2%?；虮磉_(dá)豐度RPKM值顯示上調(diào)基因9 415個(gè)，下調(diào)基因28 980個(gè)，其中參與病原互作的基因占680個(gè)。

關(guān)鍵詞 煙草疫霉；侵染；劍麻；轉(zhuǎn)錄組

中圖分類號(hào) S563.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

劍麻（學(xué)名：Agave sisalana；英文名：Sisal）俗稱龍舌蘭麻[1]，為龍舌蘭科（Agavaceae）龍舌蘭屬（Agave linnaeus）多年生肉質(zhì)旱生草本植物，是熱帶、亞熱帶地區(qū)栽培的重要硬質(zhì)纖維作物及重要的工業(yè)原料，應(yīng)用廣泛。除纖維外，其液汁可提取貴重藥物生產(chǎn)原料皂素；麻渣含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是良好的飼料和肥料[2]。中國(guó)是世界劍麻主要生產(chǎn)國(guó)之一，產(chǎn)地主要分布在廣東、廣西、海南、云南、福建等熱帶和亞熱帶地區(qū)，主栽品種為劍麻H.11648（Agave hybrid No.11648）[3]。該品種葉片寬厚，產(chǎn)量高，但容易感染由煙草疫霉（Phytophthora nicotianaeBreda.）引起的斑馬紋病（Zebra disease，ZD）[4]。該病1961年首次在坦桑尼亞發(fā)生，后傳播到中國(guó)等世界各地，對(duì)劍麻產(chǎn)業(yè)造成極大的損失，為劍麻周期產(chǎn)量影響最大的病害之一[5]。由于形態(tài)和真菌很相似，過去曾將煙草疫霉歸為真菌，實(shí)為色菌界（Chromista）二倍體真核微生物[6]，其區(qū)別于真菌的顯著之處是細(xì)胞壁不含幾丁質(zhì)成分，因而傳統(tǒng)的針對(duì)幾丁質(zhì)的殺菌劑，對(duì)殺滅煙草疫霉等卵菌幾乎無效[7-8]。防治煙草疫霉的常用藥劑多為苯基酰胺類及乙磷鋁等同一種或作用機(jī)制相同的幾種內(nèi)吸性殺菌劑，很容易產(chǎn)生耐藥性，從而引起藥效下降[9]。

轉(zhuǎn)錄組研究是一種發(fā)掘功能基因的重要途徑，是基因功能及結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)和出發(fā)點(diǎn)。了解轉(zhuǎn)錄組是解讀基因組功能元件和揭示細(xì)胞及組織中分子組成所必需的，并且對(duì)理解機(jī)體發(fā)育和疾病具有重要作用[10]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)相對(duì)于基因組學(xué)而言，只研究被轉(zhuǎn)錄的基因，研究范圍縮小，針對(duì)性更強(qiáng)[11]。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）是利用大規(guī)模測(cè)序技術(shù)直接對(duì)cDNA序列進(jìn)行測(cè)序，產(chǎn)生數(shù)以千萬計(jì)的reads片段，從而使得一段特殊的基因組區(qū)域的轉(zhuǎn)錄水平可以直接通過比對(duì)該基因組區(qū)域的reads數(shù)來衡量[12]。通過轉(zhuǎn)錄組分析，可高通量地獲得基因表達(dá)的RNA水平，從而揭示基因與生命現(xiàn)象之間的內(nèi)在聯(lián)系。據(jù)此可以了解細(xì)胞生理活動(dòng)規(guī)律，確定細(xì)胞代謝特性，并進(jìn)而對(duì)細(xì)胞進(jìn)行修飾改造[13-14]。目前，轉(zhuǎn)錄組學(xué)用于植物和病原菌研究的很多。但是，用轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究劍麻與煙草疫霉互作機(jī)理的文章還未見報(bào)道。本研究在RNA-seq技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過對(duì)一系列數(shù)據(jù)的分析、比對(duì)，得到劍麻對(duì)煙草疫霉侵染的應(yīng)答基因，以期為將來轉(zhuǎn)基因抗病育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 實(shí)驗(yàn)材料取自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院（?？冢┰簝?nèi)本實(shí)驗(yàn)室基地大棚，選取株高50～70 cm無病害、長(zhǎng)勢(shì)良好的劍麻H.11648植株，移栽入營(yíng)養(yǎng)盆后置于室內(nèi)控溫28 ℃左右培養(yǎng)備用；

1.1.2 試驗(yàn)試劑及藥品 康為世紀(jì)RNApure Plant Kit（DNaseⅠ）（Cat.No.：CW0559）試劑盒；Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit （Cat.No.：#K1622）；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 試驗(yàn)儀器 Eppendorf 5810R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)；瓊脂糖凝膠電泳儀；Tanon-4500凝膠成像系統(tǒng)；美國(guó)Thermo Nanodrop 2000微量紫外分光光度計(jì)等。

1.2 方法

1.2.1 菌株準(zhǔn)備 用于接種的煙草疫霉菌株為本實(shí)驗(yàn)室前期分離獲得，經(jīng)PDA平板活化后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 接種 選取劍麻葉片基部幼嫩部位進(jìn)行接種，先用75%酒精對(duì)其進(jìn)行消毒，再用滅菌水清洗，待干燥后接種。實(shí)驗(yàn)設(shè)處理（CL）與對(duì)照（CK）兩組，每組選5株作為接種對(duì)象，處理組在葉片基部幼嫩部位刺傷并接種煙草疫霉，對(duì)照組只做刺傷，不接種煙草疫霉，做好上述處理后，在植株葉面上方噴無菌水，并用透明薄膜將植株從底部套住以達(dá)到保濕的效果，以后每天噴水2次。

1.2.3 總RNA提取 RNA提取方法參照康為世紀(jì)RNApure Plant Kit（DNaseⅠ），接種后1、2、3、4、5 d的感病葉片等量混合后提取總RNA（CL組），同時(shí)取對(duì)照（CK組）。提取后RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)及Thermo Scientific NanoDrop 2 000分光光度計(jì)分析。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 檢測(cè)合格的RNA樣品委托深圳華大基因科技服務(wù)有限公司測(cè)序（項(xiàng)目編號(hào)：F13FTSSCKF0046）。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)

對(duì)CK和CL 2組樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后共獲得8G原始數(shù)據(jù)。其中，CK組獲得原始片段（reads）68、802、552條，去除帶接頭，重復(fù)，測(cè)序質(zhì)量低片段后clean reads數(shù)59、305、846；CL組reads數(shù)74、975、368，clean reads 66、778、374個(gè)。CL獲得的測(cè)序片段數(shù)略多于CK，這一結(jié)果與預(yù)期相符，因?yàn)镃L中除劍麻表達(dá)基因外還有煙草疫霉表達(dá)的基因，理論上比CK表達(dá)的基因多。兩者的GC含量介于45%～50%之間，較為一致。測(cè)序的堿基質(zhì)量參數(shù)（Q20）均在97%左右，不確定堿基比例0.00%（表1）。

2.2 組裝質(zhì)量統(tǒng)計(jì)

組裝質(zhì)量評(píng)估通過組裝后所得片段的長(zhǎng)度分布及其N50值來反應(yīng)，N50指從組裝最長(zhǎng)的Unigene 依次向下求長(zhǎng)度的總加和，當(dāng)這個(gè)加和達(dá)到組裝長(zhǎng)度的一半時(shí)，對(duì)應(yīng)的Unigene的長(zhǎng)度就是N50的長(zhǎng)度。N50值越大，反映組裝得到的長(zhǎng)片段越多，組裝效果越好。CK組Unigene 總數(shù)127、361，Contig總數(shù)253、520；CL組Unigene 總數(shù)153、951，Contig總數(shù)320、529。All-Unigene的長(zhǎng)度分布大致在300～3 000之間， 500～1 000 bp的Unigene最多，占總數(shù)65.39%，大于3 000 bp的大片段較少。Unigene數(shù)量隨長(zhǎng)度成遞減關(guān)系見圖1。

CK組裝轉(zhuǎn)錄組N50=275，Unigene N50=638；CL組裝轉(zhuǎn)錄組N50=299，Unigene N50=667。將上述2個(gè)處理的Uingene數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)聚類合并，作為劍麻Uingene數(shù)據(jù)庫(kù)。結(jié)果顯示，該Unigene庫(kù)共有131、422個(gè)Uingene，N50=861，組裝結(jié)果較好，能滿足后續(xù)分析需要。

2.3 Uingene的覆蓋度、深度和表達(dá)量分析

對(duì)Unigene進(jìn)行覆蓋度分析發(fā)現(xiàn)，131、422個(gè)Unigene的覆蓋范圍介于5.94%～96.91%之間；測(cè)序深度從0.059 4%～9.166 7%不等；樣品中能唯一比對(duì)到指定unigene序列的reads數(shù)（Unique-mapped-Reads）從1～299個(gè)不等；能比對(duì)到多個(gè)unigene序列的reads數(shù)（Multiple-mapped-Reads）從1～385個(gè)不等。

2.4 Unigene的功能注釋

將All-Unigene分別注釋到NR、NT、Swiss-Prot、KEGG、COG、GO 6個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中，對(duì)注釋到每個(gè)庫(kù)的Unigene數(shù)目統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。

將劍麻數(shù)據(jù)庫(kù)中Unigene比對(duì)到氨基酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)（Non-redundant sequences，Nr），結(jié)果顯示，注釋到葡萄（vitis vinifera）的Uingene最多，粳稻（oryza sativa japonica group）其次，具體物種分布見圖2。

E-Value值是序列比對(duì)到該物種的可靠性評(píng)價(jià)，它表明在隨機(jī)情況下，其它序列與目標(biāo)序列相似度要大于這條顯示的序列的可能性，因而它的值越低越好。當(dāng)E值小于10-5時(shí)，表明兩序列有較高的同源性，本次轉(zhuǎn)錄組測(cè)序All-Unigene注釋到Nr的E-value值分布圖見圖3。從圖3中可以看出，比對(duì)到的物種序列同源性均小于10-5，其中小于1e-30的序列占比對(duì)序列總數(shù)超過50%，說明比對(duì)結(jié)果可靠性很高。

對(duì)All-Unigene的注釋結(jié)果進(jìn)行物種相似性分析發(fā)現(xiàn)：多數(shù)Unigene序列比對(duì)相似性在40%～80%之間，序列相似性高于95%的很少，占All-Unigene總數(shù)不到4%，但是從整個(gè)序列相似性分布來看，對(duì)無參考基因組的劍麻All-Unigene的功能注釋結(jié)果較好。劍麻All-Unigene物種相似性分布圖見圖4。

對(duì)劍麻Unigene數(shù)據(jù)庫(kù)做蛋白相鄰類的聚簇分析COG（Cluster of Orthologous Groups of proteins）顯示：注釋到通用功能（R）的Unigene最多；轉(zhuǎn)錄組相關(guān)功能（K）其次；胞外結(jié)構(gòu)（W）和核酸結(jié)構(gòu)相關(guān)功能（Y）最少；值得一提的是，有507個(gè)Unigene被注釋到防衛(wèi)反應(yīng)（V），為后續(xù)的病原互作基因研究打下了很好的基礎(chǔ)；此外，還有3 679個(gè)未知功能的Unigene。COG分類注釋結(jié)果見表3。

2.5 Unigene的GO分類

Gene Ontology（簡(jiǎn)稱GO）是一個(gè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化的基因功能分類體系，對(duì)劍麻Unigene數(shù)據(jù)庫(kù)做GO分類分析發(fā)現(xiàn)：共有42 987個(gè)Unigene注釋到GO數(shù)據(jù)庫(kù)，且較多的單個(gè)基因可以與多種基因相對(duì)應(yīng)，最多的一個(gè)基因“CL4909.Contig1_All”可以同時(shí)與GO數(shù)據(jù)庫(kù)中69個(gè)基因相似。建立了42 987個(gè)對(duì)應(yīng)關(guān)系，從而得到更多的分類和注釋信息。劍麻轉(zhuǎn)錄組中Unigene根據(jù)GO功能分類可分為3個(gè)ontology，其中生物過程（biological process）類中基因最多（152 835）；細(xì)胞組分（cellular component）其次（129 197）；分子功能（molecular function）最少（47 420）。各分支中基因表達(dá)豐度不盡相同。

2.6 Unigene的KEGG代謝通路分析

根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)代謝通路可以將劍麻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分成128類，包括生化代謝途徑、次生代謝產(chǎn)物合成、內(nèi)吞作用、環(huán)甘油磷脂代謝、植物-病原互作、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、苯丙氨酸代謝、萜類化合物生物合成、過氧化物酶體、類黃酮生物合成、基底轉(zhuǎn)錄因子、泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解等。其中，參與生化代謝通路的Unigene最多，有9 354個(gè)（占總數(shù)的27.09%）；參與植物-病原互作代謝通路的基因有1 795（5.2%）個(gè)；參與苯丙素生物合成的基因有431（1.25%）個(gè)；參與吞噬體的基因有412（1.19%）個(gè)；參與過氧化物酶體的基因有284（0.82%）個(gè)；參與黃酮類生物合成的基因有227 （0.66%）個(gè)；參與苯丙氨酸代謝的基因有224（0.65%）個(gè)；參與萜類生物合成的基因有122（0.35%）個(gè)；參與黃酮和黃酮醇類生物合成的基因有107（0.31%）個(gè)；參與天然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用的基因有106（0.31%）個(gè)；參與異黃酮合成的基因有47（0.14%）個(gè)；參與倍半萜和三萜生物合成的基因有37（0.11%）個(gè)。

2.7 差異基因分析

對(duì)劍麻數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行差異分析發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)錄本中有38 395個(gè)差異表達(dá)Unigene，其中上調(diào)基因9 415個(gè)，下調(diào)基因28 980個(gè)；對(duì)Unigene的表達(dá)量計(jì)算采用RPKM算法，計(jì)算公式為：RPKM=（1 000 000×C）/（N×L×1 000），設(shè)RPKM為Unigene A的表達(dá)量，則C為比對(duì)到Unigene A的reads數(shù)，N為比對(duì)到所有Unigene的總reads數(shù)，L為Unigene A的堿基數(shù)；用log2（CL_RPKM/CK_RPKM）來表示2個(gè)處理所表達(dá)基因的差異倍數(shù)；用FDR（False Discovery Rate）值來進(jìn)行多重檢驗(yàn)控制錯(cuò)誤率，本研究取FDR≤0.001。對(duì)處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析，篩選植物-病原互作相關(guān)的基因發(fā)現(xiàn)：在所有680個(gè)植物-病原互作相關(guān)基因中，有309個(gè)為上調(diào)表達(dá)基因，其log2（CL_RPKM/CK_RPKM）值自12.151 1至1.003 8不等，下調(diào)基因371個(gè)，log2（CL_RPKM/CK_RPKM）值自-1.0005至-14.119 7不等。

再根據(jù)表達(dá)倍數(shù)差異優(yōu)先選取前50位上調(diào)/下調(diào)基因共100個(gè)，以進(jìn)行后續(xù)干擾表達(dá)和超表達(dá)研究，這100個(gè)基因是注釋到Nr-annotation數(shù)據(jù)庫(kù)后，剔除疫霉基因所獲。通過對(duì)這些基因的初步分析發(fā)現(xiàn)：⑴在差異倍數(shù)上，上調(diào)基因差異倍數(shù)最大為log2（CL_RPKM/CK_RPKM）等于15.851 2，最小為13.842 6；下調(diào)表達(dá)基因中，下調(diào)倍數(shù)最多為-13.998 5，最少有-12.304 2。⑵注釋到Nt-annotation和Nr-annotation數(shù)據(jù)庫(kù)后，有67個(gè)Unigene可以比對(duì)到兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，還有33個(gè)無法比對(duì)到序列。比對(duì)結(jié)果如下：葡萄（Vitis vinifera）17；二蕙短柄草（Brachypodium distachyon）7；毛果楊（Populus trichocarpa）6；水稻（Oryza sativa Japonica Group）6；蓖麻（Ricinus communis）5；高粱（Sorghum bicolor）4；櫓豆（Glycine max）3；擬南芥（Arabidopsis thaliana）3；苜蓿（Medicago truncatula）2；大麥（Hordeum vulgare subsp. Vulgare）2；玉米（Zea mays）2；藍(lán)桉（Eucalyptus globulus subsp. Globulus）1；閉鞘姜（Costus speciosus）1；紅松（Pinus koraiensis）1；黑麥（Secale cereale）1；歐芹（Petroselinum crispum）1；煙草（Nicotiana tabacum）1；蘭花（Cymbidium hybrid cultivar）1；沉水樟（Cinnamomum micranthum f. kanehirae）1；芝麻（Sesamum indicum）1；油棕（Elaeis guineensis）1。

經(jīng)過以上的基礎(chǔ)生物信息學(xué)分析，再擇優(yōu)選取Unigene構(gòu)建載體進(jìn)行RNA干擾和超表達(dá)轉(zhuǎn)基因研究。

2.8 植物-病原菌互作通路分析

生物體內(nèi)不同基因間通過相互協(xié)調(diào)作用來完成某一生物學(xué)功能，Pathway顯著性富集能確定差異表達(dá)基因參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。以KEGG Pathway為單位，背景序列的KO號(hào)通過同blast比對(duì)來獲取，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出與整個(gè)基因組背景相比，在差異表達(dá)基因中顯著富集的pathway，一般Qvalue值設(shè)為≤0.05?；赑athway的植物-病原物互作通路的分析有助于更進(jìn)一步了解劍麻與斑馬紋病互作的機(jī)理，其代謝通路見圖5。

圖中每一小方框代表一個(gè)代謝控制點(diǎn)，方框由黑、紅、綠三色組成，紅色部分代表此處有上調(diào)基因表達(dá)，綠色代表下調(diào)基因，全紅或全綠代表此處基因全部上調(diào)或下調(diào)，黑色代表此處無基因差異表達(dá)。從圖中可以看出，病原互作這一通路中，各代謝支路相互交錯(cuò)，基因間通過各自的上調(diào)或下調(diào)來共同完成這一生命活動(dòng)。

3 討論與結(jié)論

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)y(cè)序樣品RNA純度、完整度及濃度均要求較高，鑒于劍麻成熟葉片纖維含量豐富[15]，提取葉片RNA時(shí)很難達(dá)到測(cè)序的濃度和純度要求，取樣時(shí)選取株高50～70 cm的劍麻基部幼嫩葉片做為RNA提取材料。實(shí)驗(yàn)證明，在該部位接種煙草疫霉病原菌提取總RNA能達(dá)到測(cè)序的A類標(biāo)準(zhǔn)要求，是理想的取材部位。

本研究劍麻All-Unigene數(shù)據(jù)庫(kù)有95.31%（60341）的Unigenen被注釋到Nr數(shù)據(jù)庫(kù)，跟番薯[16]，芝麻[17]，蘿卜[18]46.21%，53.91%，85.51%的注釋比例相比有顯著的提高，究其原因主要跟測(cè)序技術(shù)的進(jìn)一步成熟以及拼接水平的提升有關(guān)[16]。此外，注釋到NT、Swiss-Prot、KEGG、COG、GO數(shù)據(jù)庫(kù)的比例也相對(duì)較高，分別為66.81%、59.25%、54.53%、32.96%、67.90%，說明此次測(cè)序結(jié)果相對(duì)較好。

實(shí)驗(yàn)需用煙草疫霉對(duì)劍麻植株進(jìn)行侵染，這樣勢(shì)必導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中含有煙草疫霉表達(dá)的基因，而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果?？梢岳帽疚奶岬降姆椒?，即生物信息學(xué)分析剔除干擾基因，或者根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要設(shè)置煙草疫霉侵染其他寄主植株的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序以消除干擾。

對(duì)2個(gè)處理的樣本進(jìn)行差異表達(dá)基因分析旨在找到劍麻抗斑馬紋病病原互作相關(guān)基因，為轉(zhuǎn)基因抗病育種奠定基礎(chǔ)。本研究通過將兩個(gè)樣本比對(duì)到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，找到植物-病原互作通路基因680個(gè)，并給出了2個(gè)樣本間差異表達(dá)基因的差異倍數(shù)關(guān)系。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)其苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL，E.C. 4.3.1.5）Unigene基因均有不同程度上調(diào)現(xiàn)象，上調(diào)倍數(shù)自log21.1654至log26.6458不等，而在植物抗病反應(yīng)的次生代謝中，苯丙氨酸解氨酶是形成植保素、木質(zhì)素和酚類化合物等抗病次生物質(zhì)代謝途徑中的關(guān)鍵酶和限速酶[19]，說明劍麻在抗斑馬紋病病原菌侵染過程中，苯丙氨酸解氨酶發(fā)揮了較大作用。

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