鄧小芳　何敏　周怡等

摘要：目的 凝溶膠蛋白（Gelsolin， GSN）是凝溶膠蛋白超家族的成員之一，被發(fā)現(xiàn)對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用。本研究旨在構(gòu)建GSN雙標(biāo)簽慢病毒載體，發(fā)現(xiàn)GSN過表達(dá)肝癌SMMC7721細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組新基因。方法 PCR擴(kuò)增GSN cds全長(zhǎng)片段，接入帶FLAG-HA雙重標(biāo)簽的PCDH-CMV-MCS-EFl-Puro慢病毒載體中，經(jīng)測(cè)序鑒定的重組質(zhì)粒，病毒包裝后轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞SMMC7721，嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系；In-Cell Western（ICW）檢測(cè)GSN在SMMC7721肝癌細(xì)胞中的表達(dá)，Ion proton測(cè)序系統(tǒng)對(duì)轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染的肝癌細(xì)胞進(jìn)行mRNA測(cè)序。結(jié)果 測(cè)序表明重組質(zhì)粒DNA序列與NCBI檢索到的GSN編碼序列一致；ICW檢測(cè)到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中GSN蛋白的表達(dá)為未處理細(xì)胞的2.02倍（P<0.05）；轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)新基因21個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)基因12個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因9個(gè)，6個(gè)基因上調(diào)和4個(gè)基因下調(diào)的絕對(duì)表達(dá)值倍數(shù)變化均>4。結(jié)論 基于GSN穩(wěn)定表達(dá)的SMMC7721肝癌細(xì)胞株所發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄新基因，為研究GSN在肝癌中的作用機(jī)制開拓新方向。

關(guān)鍵詞：GSN；SMMC7721；慢病毒載體；轉(zhuǎn)錄組；新基因

GSN是一個(gè)鈣離子和二磷酸磷脂酰肌醇依賴性肌動(dòng)調(diào)節(jié)蛋白，主要有細(xì)胞質(zhì)型和分泌型兩個(gè)亞型，在細(xì)胞骨架重塑、免疫反應(yīng)及磷酸肌醇信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用[1]。研究表明GSN與引發(fā)細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)蛋白酶之一半胱天冬酶-3（CPP-32）作用，參與細(xì)胞凋亡[2]，同時(shí)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和腫瘤轉(zhuǎn)移也具有促進(jìn)作用。本研究通過改造PCDH-CMV-MCS-EFl-Puro慢病毒載體，構(gòu)建人GSN穩(wěn)定表達(dá)的SMMC7721肝癌細(xì)胞株，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)進(jìn)一步研究GSN過表達(dá)后對(duì)肝癌差異表達(dá)新基因的影響，為探討GSN在肝癌中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1資料與方法

1.1一般材料 肝癌細(xì)胞SMMC7721及293T細(xì)胞購于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫，澳洲胎牛血清購于Bioind公司，RPMI 1640培養(yǎng)基及DMEM 高糖培養(yǎng)基購于Hyclone公司，GSN表達(dá)載體由上海桑尼生物科技有限公司測(cè)序，X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent購于Roche，基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒大提試劑盒為天根生化科技有限公司；GSN鼠抗人一抗、GAPDH兔抗人一抗購自美國(guó)Epitomics公司，IRDye 680標(biāo)記、IRDye 800標(biāo)記的二抗購于美國(guó)LI-COR公司，RNA提取試劑盒購于Invitrogen公司，RNA 純化免疫磁珠試劑盒購于Life Technologies公司。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序交Life Technologies公司完成。

1.2載體構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染

1.2.1 PCDH-CMV-MCS-EFl-Puro載體改裝 用Xbal和BamH1酶切PCDH-CMV-MCS-EFl-Puro載體，純化回收后接入FLAG-HA tag，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后涂板，挑選陽性克隆，37℃過夜擴(kuò)增后提取質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。

1.2.2引物合成及GSN全長(zhǎng)FLAG-HA雙標(biāo)簽重組質(zhì)粒構(gòu)建 以人肝組織cDNA為模板，PCR擴(kuò)增GSN cds全長(zhǎng)片段，上游引物5′-gctccgcaccgccccgcgc-3′，下游引物5′-tggctgagctggctgcctga-3′，PCR 條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃×20 S，54℃×20 S，72℃×40 S，共28個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。用BamH1酶切改裝的載體pCDH-CMV-FLAG-HA- EF1-Puro后接入GSN，構(gòu)建出GSN全長(zhǎng)的重組質(zhì)粒，交上海桑尼生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.3病毒包裝及肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染 前1 d 293 T 鋪板，細(xì)胞60%～80% 匯合度，轉(zhuǎn)染。將病毒質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒按照比例混合，然后依照轉(zhuǎn)染試劑說明書操作。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)，3 d后搜集細(xì)胞上清，2000 rpm，5 min離心，去掉殘留在上清中的293 T 細(xì)胞，經(jīng)0.45 um 濾頭過濾，備用。如長(zhǎng)期保存置于-80℃冰箱凍存。對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的肝癌細(xì)胞SMMC7721前1 d鋪板 ，長(zhǎng)至60%～80% 匯合度，25 cm2培養(yǎng)瓶加入1 mL病毒上清、5 mL培養(yǎng)基，同時(shí)加入polybrene，至終濃度 8 μg/mL，感染后48 h，細(xì)胞1∶5 傳代后，加入嘌呤霉素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，鑒定表型。

1.3 ICW鑒定GSN表達(dá) 將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染的SMMC7721肝癌細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，用全培養(yǎng)基稀釋成1×105/mL細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔200 μL，各做5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)至細(xì)胞處于生長(zhǎng)增殖期，狀態(tài)佳。ICW實(shí)驗(yàn)過程參照Yuli Wan[3]等的研究。GSN一抗及GAPDH內(nèi)參濃度分別為1∶100和1∶400，鼠、兔二抗?jié)舛染鶠?∶5000。

1.4 Ion Proton轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SMMC7721肝癌細(xì)胞各兩個(gè)75cm2培養(yǎng)瓶，進(jìn)行總RNA提取，過程中注意避免RNA酶，測(cè)量OD值后確定樣本濃度，混合總RNA，使兩個(gè)樣本的RNA含量均>100 μg，分離純化mRNA，使其含量達(dá)5～400 ng，構(gòu)建全轉(zhuǎn)錄組文庫，制備模板后交Life Tech公司應(yīng)用Ion Proton系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.5生物信息學(xué)分析 Proton Torrent服務(wù)器預(yù)加載了Torrent Suite軟件，測(cè)序分析獲得的數(shù)據(jù)自動(dòng)傳至Proton Torrent服務(wù)器，作覆蓋分析、作圖、變異識(shí)別等檢測(cè)，Ion Reporter軟件進(jìn)行生物學(xué)功能注釋和常見變異體的鑒定。對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)覆蓋度、對(duì)比信息統(tǒng)計(jì)，與GenBank中核酸序列進(jìn)行同源性比較，差異片段無同源性>95%的基因，屬新基因片段。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)Mann-Whitney Test分析，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 GSN全長(zhǎng)FLAG-HA雙標(biāo)簽重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 PCDH-CMV-MCS- EFl-Puro慢病毒載體經(jīng)改裝后，接入GSN全長(zhǎng)片段構(gòu)建成FLAG-HA-GSN重組質(zhì)粒，測(cè)序鑒定質(zhì)粒的核苷酸序列與預(yù)期符合，見圖1，成功構(gòu)建了GSN真核表達(dá)載體。

2.2 GSN穩(wěn)定表達(dá)肝癌細(xì)胞株的ICW鑒定 Odyssey紅外熒光掃描系統(tǒng)掃描GSN蛋白信號(hào)并定量，獲得表達(dá)灰度值后，采用非參數(shù)檢驗(yàn)Mann-Whitney Test分析結(jié)果，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中GSN蛋白的表達(dá)為未處理細(xì)胞的2.02倍，兩組的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖2。

2.3轉(zhuǎn)錄組測(cè)序檢測(cè)mRNA水平的表達(dá) 測(cè)序結(jié)果以FPKM法計(jì)算基因表達(dá)量，樣本間mRNA測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果的差異比較，用讀段的絕對(duì)表達(dá)值倍數(shù)變化（fold change）分析。測(cè)序數(shù)據(jù)分析表明GSN過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，與未轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)新基因共21個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)基因12個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因9個(gè)，6個(gè)基因上調(diào)和4個(gè)基因下調(diào)的絕對(duì)表達(dá)值倍數(shù)變化均>4，見表1。

3討論

隨著功能基因研究的深入，細(xì)胞轉(zhuǎn)染已成為常見的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一，而慢病毒轉(zhuǎn)染憑其轉(zhuǎn)染率高、轉(zhuǎn)染穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)[4]。本研究通過對(duì)PCDH-CMV-MCS-EFl-Puro慢病毒載體的改造，在載體中接入FLAG-HA標(biāo)簽，構(gòu)建成GSN雙標(biāo)簽重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞SMMC7721，并通過嘌呤霉素的篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)GSN的肝癌細(xì)胞株。在穩(wěn)定表達(dá)的肝癌細(xì)胞鑒定GSN的表達(dá)水平，采用新興的ICW技術(shù)。ICW基于細(xì)胞培養(yǎng)板的原位目標(biāo)蛋白定量，免去了蛋白提取、SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜等多個(gè)實(shí)驗(yàn)流程，最大程度的避免了操作中的系統(tǒng)誤差和人為誤差，能客觀的反應(yīng)GSN蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的真實(shí)情況，同時(shí)具有高通量、高靈敏度的特點(diǎn)。以未轉(zhuǎn)染真核載體的SMMC7721肝癌細(xì)胞為對(duì)照，利用ICW驗(yàn)證轉(zhuǎn)染前后GSN 的蛋白和mRNA水平的表達(dá)，結(jié)果表明，GSN蛋白水平在轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)上調(diào)，成功構(gòu)建了GSN穩(wěn)定轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞SMMC7721細(xì)胞株，為進(jìn)一步研究GSN在肝癌中的調(diào)控作用機(jī)制奠定了研究基礎(chǔ)。

在肝癌研究中，差異表達(dá)基因的篩選，可以為深人了解肝癌發(fā)生發(fā)展過程的機(jī)制研究提供理論依據(jù)，本研究在構(gòu)建成GSN穩(wěn)定上調(diào)表達(dá)細(xì)胞株的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用Ion Proton轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染的肝癌細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞mRNA差異表達(dá)。Ion Proton測(cè)序采用半導(dǎo)體技術(shù)，可以在短時(shí)間內(nèi)以低費(fèi)用得到高質(zhì)量的mRNA定量測(cè)序結(jié)果[5]。此外，與基因芯片技術(shù)相比，RNA測(cè)序技術(shù)不需要用已知基因注釋設(shè)計(jì)檢測(cè)探針，因而能檢測(cè)尚未注釋的新基因，新基因的發(fā)現(xiàn)在疾病研究中具有十分重要的價(jià)值。本文充分利用RNA測(cè)序的優(yōu)勢(shì)，檢測(cè)轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞的差異表達(dá)新基因。結(jié)果表明GSN過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，與未轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)新基因21個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)基因12個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因9個(gè)，尤其是6個(gè)基因上調(diào)和4個(gè)基因下調(diào)的絕對(duì)表達(dá)值倍數(shù)變化均>4，均可能為GSN在肝癌發(fā)生發(fā)展過程的調(diào)控基因。

近來的研究發(fā)現(xiàn)GSN在乳腺癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌和口腔癌等多種人類腫瘤中低表達(dá)[6]，隨著腫瘤病程的發(fā)展和腫瘤轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)，GSN的表達(dá)又呈逐漸上升趨勢(shì)，有助于幫助臨床判斷病程和預(yù)后，并可作為潛在的腫瘤轉(zhuǎn)移因子。雖然有報(bào)道認(rèn)為GSN通過抑制p53基因的轉(zhuǎn)錄活性抑制了P53對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)功能[7]，但GSN在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用還不清楚。本研究利用GSN穩(wěn)定表達(dá)的SMMC7721肝癌細(xì)胞株所發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄新基因，為研究GSN在肝癌中的作用機(jī)制開拓新方向。

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編輯/肖慧