昌偉 李子龍 胡燦麗 范敬偉 王建立 楊瑞

(1.北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；2.北京農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點實驗室，北京 102206)お

摘要

［目的］探索過量表達miR319和過量表達LA對番茄果實品質(zhì)的影響。［方法］以番茄野生型M82、過量表達miR319和過量表達LA番茄為材料，分析過量表達miR319和過量表達LA對番茄果實品質(zhì)的影響。［結(jié)果］過量表達miR319植株的可滴定酸、可溶性糖、V瑿和番茄紅素的含量下降，而過量表達LA植株的可滴定酸、可溶性糖、番茄紅素的含量上升，V瑿含量下降。2個轉(zhuǎn)基因植株可溶性蛋白的含量與M82比較都有所上升。［結(jié)論］過量表達miR319和過量表達LA對番茄果實品質(zhì)的影響是相反的，過量表達LA可以提高番茄果實品質(zhì)。

關(guān)鍵詞 番茄（玈olanumlycopersicum）；miR319；番茄品質(zhì)

中圖分類號 SB188文獻標(biāo)識碼 A文章編號 0517-6611（2014）19-06150-02

お

Effect of Over睧xpression miR319 on Fruit Quality of Tomato

CHANG Wei, YANG Rui et al

(College of Plant Science and Technology, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206)

Abstract ［Objective］ The present study aimed to explore the effects of over瞖xpression miR319 and over瞖xpression LA on fruit quality of tomato. ［Method］ Effects of over瞖xpression miR319 and over瞖xpression LA on fruit quality of tomato were analyzed by using tomato wild type M82, over瞖xpression miR319 and over瞖xpression LA as material. ［Result］ The results showed that: The over瞖xpression jaw睤 titratable acid, soluble sugar content V瑿 and Lycopene content were decreased, but over瞖xpression LA, plant titratable, soluble sugar content and Lycopene content were increased, and V瑿 content was decreased. And two transgenic plants soluble protein content were better than M82. ［Conclusion］ The effects of over瞖xpression of miR319 and over瞖xpression LA on fruit quality of tomato are opposite and overexpression LA can improve fruit quality .

Key words Tomato; MiR319; Tomato nutritional quality

お

基金項目 長城學(xué)者（CIT·&·TCD20130323）。

作者簡介

昌偉（1989-），男，安徽滁州人，碩士研究生，研究方向：蔬菜生理與優(yōu)質(zhì)安全栽培。*通訊作者，實驗師，從事蔬菜生理與優(yōu)質(zhì)安全研究。

收稿日期 20140531

番茄（玈olanumlycopersicum）是蔬菜中營養(yǎng)價值較高的品種之一，也是近年來我國設(shè)施栽培面積較大的作物。番茄果實的發(fā)育是通過一系列生物和非生物因素相互調(diào)控的。茉莉酸作為植物調(diào)節(jié)劑，可以在番茄的整個生長過程起到非常重要的作用。魏佳等［1］發(fā)現(xiàn)利用茉莉酸突變體玸pr2發(fā)現(xiàn)茉莉酸能夠促進果實發(fā)育時期還原糖的積累。張佳楠等［2］利用Micro-Tom為試驗材料，外源噴施茉莉酸甲酯，發(fā)現(xiàn)番茄果實中果糖和葡萄糖含量在整個生長發(fā)育期都呈遞增趨勢。Schommer等［3］研究發(fā)現(xiàn)，miR319的靶基因TCP轉(zhuǎn)錄因子家族成員調(diào)控茉莉酸生物合成進程中關(guān)鍵酶基因LOX2從而控制著茉莉酸的生物合成。筆者以M82為背景的過量表達miR319和過量表達LA為材料，比較3個品種番茄果實的品質(zhì)差異，探索miR319對番茄果實的影響，以期為番茄的進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1 材料

試驗于2013年10月~3月在北京金六環(huán)農(nóng)業(yè)園進行。試驗材料為番茄野生種M82，以M82為背景的過量表達miR319和過量表達LA的轉(zhuǎn)基因番茄。取新鮮果實，研磨成原漿，按照不同試驗要求精確稱量勻漿，然后進行各項品質(zhì)指標(biāo)的測定。

1.2 可溶性蛋白的測定

用考馬斯亮藍G-250法測定［4］。準(zhǔn)確稱取4.000 g番茄果實勻漿，加入10 ml蒸餾水混勻，于4 ℃、12 000 r/min離心20 min，收集上清液即為可溶性蛋白溶液。吸取1.0 ml上清液，加入5.0 ml考馬斯亮藍G-250溶液，充分混合，放置2 min后在波長595 nm出比色。重復(fù)3次。

1.3 可溶性糖的測定

采用硫酸蒽酮比色法［4］，準(zhǔn)確稱取0.500 g番茄果實勻漿，加入到15 ml蒸餾水中，沸水煮沸20 min，冷卻后定容至25 ml。離心10 min（5 000 r/min），上清液為待測液，在620 nm下測得吸光度。重復(fù)3次。

1.4 有機酸總量的測定

采用標(biāo)準(zhǔn)堿滴定定量法。取10.0 g勻漿，約用50 ml已煮沸、冷卻的蒸餾水定容 250 ml。充分振蕩后過濾。吸取20 ml濾液，加入酚酞，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液滴定。重復(fù)3次。

1.5 維生素C的測定

采用2,6-二氯酚靛酚法測定［4］。準(zhǔn)確稱取5.000 g番茄果實勻漿，加入10 ml濃度2%草酸，轉(zhuǎn)移到50 ml容量瓶中定容。用高嶺土和溶液混合，過濾。取10 ml濾液，用已標(biāo)定的2,6-二氯酚靛酚溶液滴定。重復(fù)3次。

1.6 番茄紅素的測定

用GB/T 14215-2008番茄醬罐頭標(biāo)準(zhǔn)中測量番茄紅素的方法測量［5］。準(zhǔn)確稱取0.200 g番茄果實勻漿，置于10 ml燒杯中，加入少量無水甲醇，過濾，反復(fù)至無色，保留殘渣。分次用少量甲苯浸提番茄紅素，過濾，至濾液無色，濾液定容至50 ml。在485 nm下測定提取液的吸光度。重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)應(yīng)用Excel2007、spss19.0和origin8分別進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計、差異顯著性分析和作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因植株對番茄果實可溶性糖的影響

圖1表明，M82、過量表達miR319植株、過量表達LA植株的含糖量分別是5.69%、4.52%和7.49%。過量表達miR319之后番茄果實的含糖量下降，而過量表達miR319靶基因LA之后，番茄果實的含糖量上升。這可能是在番茄果實成熟時，糖含量受到miR319的調(diào)控，從而使番茄果實的含糖量下降。結(jié)果表明，在番茄果實成熟時，過量表達miR319植株的番茄果實含糖量下降，而過量表達LA植株的番茄果實含糖量上升。miR319可能單獨或者聯(lián)合其他機制調(diào)控果實糖積累時的過程，是果實內(nèi)的糖含量發(fā)生變化。

注：不同大寫字母表示差異極顯著，不同小寫字母表示差異顯著，相同字母表示差異不顯著，下同。

圖1 不同番茄果實含糖量

2.2 轉(zhuǎn)基因植株對番茄果實可滴定酸的影響

圖2表明，M82果實的可滴定酸含量為0.61%，過量表達miR319植株的果實可滴定酸含量為0.48%，下降0.13%，下降達到極顯著（㏄<0.01）。過量表達LA果實的可滴定酸含量增加0.1%，增加達到極顯著（玃<0.01）。這可能在番茄果實成熟的過程中，可滴定酸含量受到miR319的負調(diào)控，從而使番茄果實內(nèi)的可滴定酸含量下降；而過量表達miR319靶基因LA時，抑制了miR319的表達，使番茄果實內(nèi)的可滴定酸含量┥仙。

圖2 不同番茄果實可滴定酸含量

2.3 轉(zhuǎn)基因植株對番茄果實可溶性蛋白的影響

圖3表明，M82、過量表達miR319植株、過量表達LA植株的蛋白質(zhì)含量為分別是122.1、138.5和134.4 μg/g。過量表達miR319和過量表達LA植株番茄果實的可溶性蛋白相對于M82來說分別上升16.4和13.3 μg/g，上升都達到了顯著性（玃<0.05）。有可能是在番茄果實成熟的過程中，過量表達miR319和過量表達LA植株體內(nèi)的誘導(dǎo)番茄果實中其他蛋白質(zhì)的表達，使果實內(nèi)的可溶性蛋白含量上升。

圖3 不同番茄可溶性蛋白含量

2.4 轉(zhuǎn)基因植株對番茄果實維生素C的影響

圖4表明，M82、過量表達miR319和過量表達LA的維生素C的含量分別是1 762.7、1 440.7和1 593.2 mg/kg。結(jié)果表明，在番茄果實成熟時，過量表達miR319植株的番茄果實和過量表達LA植株的番茄果實的維生素C含量都有所下降。與野生番茄M82相比較都有極顯著差異（玃<0.01）。在番茄果實成熟的時候，過表達miR319和過表達LA的維生素C含量下降。

圖4 不同番茄維生素C含量

2.5 轉(zhuǎn)基因植株對番茄果實番茄紅素的影響

圖5表明，M82、過量表達miR319和過量表達LA的番茄紅素含量分別為89.0、84.0和98.0 mg/kg FW。與M82相比，過量表達miR319植株的番茄果實番茄紅素下降5.0 mg/kg FW，而過量表達LA植株的番茄果實番茄紅素上升9.0 mg/kg FW，效果顯著（玃<0.05）。汪俏梅等［6］研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源茉莉酸能通過郵箱番茄紅素合成相關(guān)基因而正調(diào)控番茄紅素的合成，MeJA處理可以提高番茄紅素的合成。試驗結(jié)果表明，在過量表達miR319植株中，miR319負調(diào)控茉莉酸合成通路中Lox2基因，使番茄內(nèi)的茉莉酸含量下降，從而使果實內(nèi)的番茄紅素下降。而在過量表達LA植株中，正向調(diào)控茉莉酸表達，使番茄中茉莉酸含量上升，使番茄果實內(nèi)的番茄紅素含量上升。

圖5 不同番茄紅素含量

3結(jié)論與討論

番茄作為模式植物，在番茄的轉(zhuǎn)基因上科學(xué)家們做了大量的試驗，主要包括一些抗病蟲害、提高產(chǎn)量、延遲成熟等品種。1994年，Calgene公司第1次將多聚半乳糖醛酸酶的反

義cDNA轉(zhuǎn)入番茄的基因組中，首先研制出了延遲成熟的轉(zhuǎn)基因番茄Flavr-SavrTMP中，并被批準(zhǔn)用于商業(yè)化種植，這給研制轉(zhuǎn)基因番茄提供了可行性。但是現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因食品在國內(nèi)沒有得到大范圍的推廣。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在過量表達miR319植株番茄果實中可溶性糖和可溶性蛋白都有所下降，說明在番茄果實成熟期，過量表達miR319植株體內(nèi)中miR319表達量的提高，導(dǎo)致植株體內(nèi)茉莉酸含量下降，使可溶性糖和可溶性蛋白的含量下降，而在過量表達miR319靶基因LA植株中，使茉莉酸含量上升，可溶性糖和可溶性蛋白的含量上升，這與前人的研究一致［1］。激素對植物體的整個生長發(fā)育的調(diào)節(jié)機制是非常復(fù)雜的，通常果實發(fā)育并不是由單一激素來調(diào)控的，大多是多個激素共同調(diào)控的結(jié)果。所以下一步的工作可以通過對多個激素共同的作用來研究對番茄果實的影響。

利用轉(zhuǎn)基因植株來研究果實的生長機制和提高番茄產(chǎn)量是農(nóng)業(yè)科學(xué)非常重要的手段。從試驗結(jié)果到生產(chǎn)實踐是需要非常長的時間和機制。試驗僅僅是從果實品質(zhì)來評價轉(zhuǎn)基因番茄，如果后期要大面積推廣，應(yīng)該嚴(yán)格按照國家關(guān)于轉(zhuǎn)基因作物的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進行評價，并且在種植過程中為防止轉(zhuǎn)基因番茄破壞生態(tài)平衡，應(yīng)該在相對封閉的環(huán)境中種植和管理，要嚴(yán)格與傳統(tǒng)的農(nóng)作物分開，規(guī)范轉(zhuǎn)基因番茄的生產(chǎn)和加工過程。

參考文獻

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