顏彥 胡偉

摘 要 從二穗短柄草中擴增得到一個2C型蛋白磷酸酶基因，命名為BdPP2C1。BdPP2C1與擬南芥中PP2C家族進行系統(tǒng)進化分析，結果表明，BdPP2C1與擬南芥A類PP2C家族成員的親緣關系較近。利用實時熒光定量PCR表達分析系統(tǒng)，分析在非生物逆境脅迫及相關信號分子處理下BdPP2C1基因的表達情況。結果表明：該基因的表達受脫落酸（ABA）和雙氧水抑制，并且受滲透和低溫脅迫誘導。因此，BdPP2C1是非生物逆境脅迫中的一個應答因子，并且可能受相關信號分子調控。

關鍵詞 短柄草；PP2C；克?。槐磉_

中圖分類號 Q344 文獻標識碼 A

由蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化的蛋白質的磷酸化和去磷酸化不僅是生物體內代謝調節(jié)的重要途徑，而且也在細胞信號轉導過程中發(fā)揮著重要作用。此前的研究熱點主要集中在蛋白激酶上[1-4]，但近幾年的研究結果發(fā)現(xiàn)，蛋白磷酸酶在信號轉導中也起著非常重要的調控作用，尤其體現(xiàn)在植物對高鹽、干旱及低溫等環(huán)境脅迫所誘導的信號轉導途徑中[5]。2C型蛋白磷酸酶（Protein Phosphatase 2C， PP2C）是蛋白磷酸酶中的一大類，它廣泛地參與基因轉錄調控、蛋白質翻譯及翻譯后修飾、細胞周期調節(jié)、細胞凋亡信號調控、支鏈氨基酸的代謝、植物的生長發(fā)育及環(huán)境脅迫應答等多種生物學過程。PP2C通過催化去磷酸化作用負調控蛋白激酶級聯(lián)信號系統(tǒng)。H2O2、不飽和脂肪酸、Ca2+/CaM、脂質信號分子等均可調節(jié) PP2C的活性[6]。目前，已從多個物種中鑒定出了PP2C家族基因，其中人類基因組中有15個，線蟲中有8個，果蠅中有10個，酵母菌中僅有7個，而在擬南芥中發(fā)掘出80個[7-8]，在水稻中鑒定出了78個PP2C家族的基因[3]，但其中絕大部分基因的功能還未得到深入的研究[9-10]。

二穗短柄草（Brachypodium distachyon L.）與黑麥草（Lolium perenne L.）、 小麥（Triticum aestivum L.）、 大麥（Hordeum vulgare L.）和燕麥（Avena sativa L.）等同屬于早熟禾亞科，基因組序列與這些作物高度相似[11-13]。二穗短柄草具有植株個體小、生長周期短、自花受精、易被轉化、基因組?。s355 Mb）及存在不同倍性的基因組等特點，所以，二穗短柄草被麥類、牧草及能源植物研究者推選為研究溫帶禾本類植物的模式植物。二穗短柄草全基因組序列測定的完成，為其在基因組水平上的研究提供了便利[14]。然而，二穗短柄草中PP2C基因的研究尚未見報道。

本研究對二穗短柄草BdPP2C1基因進行克隆、序列分析、進化關系分析，并對其在逆境脅迫及多種信號分子處理下的表達模式進行研究。結果表明BdPP2C1基因可能參與逆境脅迫及相關信號分子的信號轉導途徑，為進一步利用轉基因的方法鑒定BdPP2C1基因的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 二穗短柄草種子由本實驗室保存。將二穗短柄草種子播種在花盆中（營養(yǎng)土和蛭石比例為3 ∶ 1），生長6周后，取其葉片進行基因克隆和表達分析。

1.1.2 主要試劑 PEG6000、NaCl、脫落酸（ABA）等生化試劑購自上海生工生物工程有限公司，RNA提取試劑盒購自天根生物科技公司，反轉錄試劑盒購自Fermentas公司，實時熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司，PCR試劑購自康為世紀生物公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的獲得 根據二穗短柄草數據庫中的序列信息（www.phytozome.org）設計1對引物（P1：ATGGCGGAGATTTGCAGCG；P2：TCACGGC

CTCGGGCGGCGC）。利用6周大的短柄草葉片RNA反轉錄的cDNA第一鏈為模板，PCR擴增該基因開放閱讀框（ORF）全長；PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收擴增片段；將回收的片段利用T4DNA連接酶連接到PMD18-T載體上，熱激轉化到大腸桿菌Top10；挑單菌落進行LB液體培養(yǎng)，堿裂解法提取質粒，進行PCR鑒定；將鑒定的陽性克隆進行測序。

1.2.2 生物信息學分析 利用BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行序列比對和結構預測，利用ORFFinder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）和GENSCAN（http：//genes.mit.edu/GEN

SCAN.html）進行開放閱讀框預測，利用MEGA軟件進行進化樹構建。

1.2.3 BdPP2C1基因的表達分析 6周大的短柄草幼苗用20% PEG6000、100 mmol/L NaCl、4 ℃低溫、100 μmol/L ABA、100 μmol/L乙烯、10 mmol/L H2O2分別處理0、1、3、6、12、24 h，提取葉片RNA，反轉錄成cDNA。以cDNA第一鏈為模板。為避免基因組DNA的污染，在RNA的提取過程中進行了基因組DNA的消化。實時熒光定量PCR采用TaRaKa公司的試劑盒，染料為SYBR Green，在吉泰生物科技有限公司Mx 3005P熒光定量PCR儀上進行。以短柄草Actin基因為內參。定量方法為2-ΔΔCt法：ΔΔCt=（CT， Target-CT， Actin）Time x-（CT， Target-CT， Actin）Time 0[15]。擴增所用引物的序列分別為：P3（BdPP2C1）：AACTGTCGCCTGCTGTTTCG；P4（BdPP2C1）：CTTCCTGGACGCCTCCTCAT；P5（BdActin）CCCGATGGACAGGTTATCACTA；P6（BdActin）

ATAGAGCCACCAATCCAAACAC。引物設計參考TaKaRa實時熒光定量標準說明書。為了保證引物的特異性，引物設計在UTR區(qū)域，PCR產物的長度維持在300 bp以內。用于實時熒光定量PCR的引物均由上海生工生物工程有限公司合成。熒光定量PCR的反應程序如下：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性7 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，循環(huán)40次。

2 結果與分析

2.1 目的基因的克隆及序列分析

從二穗短柄草數據庫中發(fā)現(xiàn)1個1 218 bp的cDNA序列，通過ORF Finder和GENACAN軟件分析結果表明，該cDNA序列有1個翻譯起始密碼子ATG，相同讀碼框內有1個終止密碼子TGA，表明此序列是一個全長基因（圖1）。該基因開放閱讀框（ORF）編碼405個氨基酸。隨后，根據該cDNA序列設計2條引物，從PEG6000滲透處理6 h的RNA反轉錄的cDNA第一鏈模板中克隆了該基因全長。測序分析結果表明，所克隆的cDNA序列與數據庫中的序列有99%的一致性，將其命名為BdPP2C1。BLASTX分析結果表明，BdPP2C1 cDNA與粗山羊草（EMT07491.1）、狗尾草（XP_004984925.1）、小麥（EMS59347.1）PP2C家族基因有較高的一致性，分別為82%、81%、78%。利用MEGA軟件，生成系統(tǒng)進化樹，其中包括80個擬南芥PP2C家族成員（圖2）。這些PP2C家族成員包含了A-L類PP2C。從進化樹結果可以看出，短柄草BdPP2C1與AtPP2C78、AtPP2C37、AtPP2C24、AtPP2C3聚在同一支上，與AtPP2C78親緣關系最近。上述結果表明本研究所克隆的cDNA序列為短柄草PP2C家族基因。

2.2 BdPP2C1基因在信號分子處理下的表達分析

在乙烯處理條件下，BdPP2C1基因的表達沒有顯著變化（圖3-B）；在ABA處理條件下，該基因的表達在處理1 h被誘導，在處理3、6、12、24 h被抑制，在處理24 h達到最小值（圖3-A）；在H2O2水處理條件下，處理1、3、6、12、24 h，BdPP2C1基因的表達均顯著被抑制（圖3-C）。上述結果表明，BdPP2C1能夠被逆境脅迫相關的信號分子ABA和雙氧水調控。

2.3 BdPP2C1基因在非生物逆境脅迫下的表達分析

在NaCl處理條件下，BdPP2C1基因的表達沒有顯著變化（圖4-A）；在PEG6000處理條件下，處理1、3、6、12、24 h，該基因的表達均能被顯著誘導，并表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，在處理6 h達到最大值（圖4-B）；在低溫處理條件下，處理3、6、12、24 h，該基因的表達能被顯著誘導，并表現(xiàn)出逐漸上升的趨勢，在處理24 h達到最大值（圖4-C）。上述結果表明，BdPP2C1基因能夠參與逆境脅迫，顯著受滲透和低溫脅迫誘導。

3 討論與結論

在低溫、干旱、高鹽等逆境脅迫下，植物通過調節(jié)特定基因的表達進而引起一系列的生理生化變化，以適應環(huán)境的多變性。已有研究證實植物體內存在依賴ABA和不依賴ABA這2種信號途徑來調節(jié)基因的表達以應對脅迫環(huán)境[16-17]。ABA作為一種關鍵的植物激素，在逆境脅迫尤其是在干旱和高鹽的環(huán)境下發(fā)揮著重要的調節(jié)作用，而由蛋白激酶和蛋白磷酸酶介導的蛋白質的磷酸化和去磷酸化在ABA信號途徑中起著非常重要的作用。高等植物中PP2C廣泛參與依賴ABA的多種生理過程，包括ABA誘導的種子萌發(fā)、氣孔關閉、幼苗根系的伸長、抗病原菌侵害、生長發(fā)育及逆境脅迫等。

近年來，ABA信號途徑的研究取得了較大的進展。在擬南芥中已經建立了較為完善的ABA信號轉導途徑。在這一信號轉導途徑中存在3個組分：PYR/PYL/RCAR（ABA受體）、 PP2C（負調控因子）、SnRK2（正調控因子）。這3個組分形成一種雙負調控系統(tǒng)：在沒有ABA存在的時候，PP2C通過直接地去磷酸化的方式抑制SnRK2；在有ABA存在的時候，ABA與受體PYR/PYL/RCAR結合，促進了PYR/PYL/RCAR與PP2C的相互作用，從而抑制PP2C并激活SnRK2[18]。因此，PP2C在ABA信號轉導過程中起著關鍵作用。在環(huán)境脅迫發(fā)生時，植物為了應對環(huán)境脅迫開啟了多種信號通路，包括ABA信號通路。因此，PP2C也通過ABA信號途徑在植物應答環(huán)境脅迫過程中起著重要作用。

植物中對于PP2C的報道主要集中在擬南芥（Arabidopsis thaliana）和水稻（Oryza sativa）中，Schweighofer等[5]報道了擬南芥中76個PP2C基因，并將它們分成10個組；Xue等[8]利用生物信息手段從擬南芥和水稻基因組中分別分離出80和78個PP2C，并分別將它們分為13和11個組。本研究擴增得到的BdPP2C1基因ORF為1 218 bp，編碼405個氨基酸。序列分析結果表明，BdPP2C1與其他物種中PP2C基因具有較高的一致性。進化分析結果表明，BdPP2C1與擬南芥AtPP2C78、AtPP2C37、AtPP2C24、AtPP2C3聚在同一支上。這些擬南芥PP2C基因都屬于A類PP2C家族基因[8]，因此，本研究所克隆的BdPP2C1是一個A類二穗短柄草PP2C基因。

先前的研究結果表明，擬南芥A類PP2C能夠在轉錄水平被ABA誘導[8]，而擬南芥A類PP2C酶活力在翻譯后水平被抑制，從而作為負調控因子參與ABA信號轉導途徑[18]。本研究中，BdPP2C1的表達在ABA處理1 h被誘導，而在ABA處理3～24 h被抑制。這些結果暗示著BdPP2C1的表達在處理早期響應ABA刺激上調表達，但隨著處理時間的延長，為了促進其酶活被抑制而在轉錄水平表現(xiàn)出被ABA抑制。因此，BdPP2C1可能是ABA信號轉導途徑的負調控因子。植物體內ABA的積累會誘導雙氧水的產生，雙氧水也作為一種信號分子參與多種生理過程。本研究結果也表明雙氧水能抑制BdPP2C1的表達。這一結果暗示著ABA介導的雙氧水的產生也可能是調控BdPP2C1的一種方式。

逆境脅迫會導致植物體內的代謝水平發(fā)生顯著變化，一些信號分子會顯著積累，如ABA、乙烯、雙氧水。這些信號分子在調控植物對逆境脅迫的適應過程中起著至關重要的作用。BdPP2C1能夠受到信號分子調控暗示著該基因也可能參與植物對逆境脅迫的應答。本研究結果表明，BdPP2C1的表達在PEG處理下表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，但總體上能夠被PEG誘導，在處理6 h達到最大值。這一結果暗示著BdPP2C1能夠快速響應滲透脅迫，并達到最大值，隨后表達水平降低。植物對逆境脅迫信號的轉導存在對信號的激活放大與失活關閉[5]。BdPP2C1對滲透脅迫應答的趨勢符合植物對逆境脅迫應答的基本模式。另外，BdPP2C1的表達對低溫脅迫的響應表現(xiàn)出逐漸上升的趨勢，表明BdPP2C1對低溫脅迫的應答較為緩慢。雖然PP2C是ABA信號途徑的負調控因子，但PP2C參與逆境脅迫表現(xiàn)出較為復雜的模式。過表達山毛櫸PP2C2降低了擬南芥對非生物逆境脅迫的耐受性[19]。然而，擬南芥PP2CG1和玉米PP2C2被報道能夠正調控植物對高鹽和低溫脅迫的耐受性[20-21]。上述結果表明，PP2C可能作為正調控或者負調控因子參與非生物逆境脅迫，其原因可能是PP2C能夠通過多種信號途徑參與植物對非生物逆境脅迫的應答。

短柄草是一種新型的模式植物，開展短柄草基因結構和功能的研究能夠促進禾谷類糧食作物的遺傳改良[22]。對短柄草PP2C家族的BdPP2C1基因功能的深入研究，將有助于理解植物對逆境脅迫的應答機制。在隨后的研究工作中，將利用RNAi或過量表達的方法構建轉基因株系，通過表型分析、生理學分析、調控途徑分析闡明BdPP2C1在逆境脅迫中的功能及作用機制。

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責任編輯：黃東杰