張海峰　王鋒　孫艷宏

【摘要】目的：離體培養(yǎng)肝原代細(xì)胞并觀察硝化應(yīng)激重要硝化物質(zhì)過氧亞硝基陰離子（ONOO-）供體SIN-1對肝原代細(xì)胞的作用。方法：酶消化法培養(yǎng)原代肝細(xì)胞。通過不同濃度ONOO-供體SIN-1作用于肝原代細(xì)胞24h，用MTT法分別檢測各組肝細(xì)胞存活率，同時加入ONOO-清除劑FeTMPyP觀察對細(xì)胞的影響。結(jié)果：200μM的SIN-1刺激24h使肝細(xì)胞存活率明顯下降，加入清除劑后能夠逆轉(zhuǎn)這種現(xiàn)象。結(jié)論：SIN-1產(chǎn)生的ONOO-對原代肝細(xì)胞造成損傷。

【關(guān)鍵詞】過氧亞硝基陰離子；肝原代細(xì)胞；MTT

【中圖分類號】R329.24 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】B【文章編號】1004-4949（2014）01-0271-01

基金項(xiàng)目：內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)青年創(chuàng)新基金（YKD2013QNCX003）和博士啟動資金

硝化應(yīng)激（Nitrative Stress）指蛋白質(zhì)的酪氨酸硝化，主要是由于機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的一氧化氮（NO）或由NO衍生的活性氮與活性氧共同聯(lián)合的生化作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)中的酪氨酸殘基硝化成3-硝基酪氨酸（3-nitrotyrosine，NT），從而對細(xì)胞產(chǎn)生多種毒性作用的病理狀態(tài)，該過程主要是通過硝化細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)，引起細(xì)胞損傷或凋亡，這種對氮類的高應(yīng)激性稱為硝化應(yīng)激[1]。隨著肝臟疾病的研究的發(fā)展發(fā)現(xiàn)，硝化應(yīng)激在多種肝臟疾病中起著重要的作用。硝化應(yīng)激通常是機(jī)體內(nèi)活性氧簇與活性氮簇同時升高共同作用產(chǎn)生的，而ONOO即是一種非常普遍的硝化劑，它可使蛋白質(zhì)中的酪氨酸殘基快速硝化成NT，從而使機(jī)體產(chǎn)生硝化應(yīng)激，進(jìn)而產(chǎn)生一系列的病理改變。目前的研究發(fā)現(xiàn)在一些肝臟疾病過程中或者病理情況下會導(dǎo)致肝臟發(fā)生硝化應(yīng)激的現(xiàn)象[2]，但是對于硝化應(yīng)激是否對肝細(xì)胞產(chǎn)生直接的作用以及其作用的具體機(jī)制尚不完全清楚。本項(xiàng)研究首先通過離體培養(yǎng)小鼠原代肝細(xì)胞后，采用ONOO-供體3-嗎啉斯德酮亞胺（3-morpholinosydnonimine，SIN-1）體外直接作用于小鼠肝原代細(xì)胞，觀察ONOO-對肝原代細(xì)胞的直接作用。

1材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

8周齡健康雄性C57小鼠，由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)動物部提供。

1.2 主要試劑

主要試劑：噻唑藍(lán)（MTT）和SIN-1均購自美國Sigma公司；5，10，15，20-四羥甲基（N-甲基-4‘-吡啶基）鐵卟啉（FeTMPyP）購自美國Cayman Chemical公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1小鼠肝原代細(xì)胞分離及培養(yǎng)：采用經(jīng)典的兩步灌流法[5]分離培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞。

1.3.2 MTT法檢測肝細(xì)胞存活率：嚴(yán)格按照試劑盒說明操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±s）表示，采用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），LSD法進(jìn)行組間兩兩比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 小鼠肝原代細(xì)胞培養(yǎng)

首先采用經(jīng)典的兩步灌流法分離培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞，離心獲得的肝細(xì)胞呈單個分散狀態(tài)，相差顯微鏡下為具有一定立體感的圓形細(xì)胞。取所獲得的肝細(xì)胞加入臺盼藍(lán)染色數(shù)秒后，至顯微鏡下進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，低倍鏡下可見活細(xì)胞呈光亮圓形，透光度好，細(xì)胞核清晰，且不被臺盼藍(lán)著色；而死細(xì)胞壁皺縮，透光度差，可被臺盼藍(lán)染成藍(lán)色。計(jì)數(shù)結(jié)果顯示活細(xì)胞率大于85%。培養(yǎng)的小鼠原代肝細(xì)胞2h后開始貼壁，24h后80%的細(xì)胞貼壁。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞形成島狀并連接成片，可見多個雙核細(xì)胞

2.2 不同濃度SIN-1對肝原代細(xì)胞存活率的影響

隨著SIN-1濃度的增加，細(xì)胞的存活率逐漸下降，當(dāng)SIN-1濃度為500μM時能造成肝原代細(xì)胞存活率嚴(yán)重下降（見表1）。后續(xù)刺激細(xì)胞的濃度將選中有作用的中間作用濃度，即200μM濃度的SIN-1進(jìn)行刺激，同時通過加入ONOO-清除劑FeTMPyP干預(yù)觀察能抑制該現(xiàn)象（見表2）。除此之外，我們發(fā)現(xiàn)單獨(dú)加入ONOO-清除劑時，對肝細(xì)胞存活率并無顯著性影響。

3討論

硝化應(yīng)激參與了多種肝臟疾病的病理生理過程。有研究表明在酒精性肝病的發(fā)生發(fā)展過程中硝化應(yīng)激參與了肝臟組織的損傷[3]，在體內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激的同時，體內(nèi)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）的表達(dá)也明顯升高，導(dǎo)致體內(nèi)硝化應(yīng)激的發(fā)生。體內(nèi)多種途徑可導(dǎo)致蛋白質(zhì)酪氨酸殘基的硝化，其中經(jīng)由過量NO與.O2-反應(yīng)生成的ONOO-介導(dǎo)的蛋白質(zhì)硝化被認(rèn)為是最主要的途徑之一[4]。本研究觀察了ONOO-供體SIN-1對原代培養(yǎng)的小鼠肝臟細(xì)胞的離體損傷作用。通過不同濃度的SIN-1產(chǎn)生不同濃度的ONOO-對原代肝細(xì)胞進(jìn)行刺激，發(fā)現(xiàn)一定濃度的SIN-1能夠降低肝細(xì)胞的存活率，說明在離體的情況下，硝化應(yīng)激重要物質(zhì)ONOO-能夠造成肝原代細(xì)胞的損傷。本實(shí)驗(yàn)為臨床上一些病理情況下由硝化應(yīng)激產(chǎn)生的肝細(xì)胞損傷提供了間接證據(jù)，對于我們進(jìn)一步研究硝化應(yīng)激在各種病理情況下對肝細(xì)胞的具體作用機(jī)制由重要作用。

參考文獻(xiàn)

[1].Rafael Radi.Nitric oxide，oxidants，and protein tyrosine nitration[J].Proc Natl Acad Sci U S A.2004；101（12）：4003-4008.

[2].林琳，周俊英.硝化應(yīng)激在酒精性肝病中的作用.[J].國際內(nèi)科學(xué)雜志2009，36（5）：264-267.

[3].周俊英，林琳，王瑋.酒精性肝病大鼠模型肝組織中硝化應(yīng)激.[J]指標(biāo)表達(dá)增強(qiáng)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床.2010，30（7）：773-774.

[4].El Assar M， Angulo J，Vallejo S，et al. Mechanisms involved in the aging-induced vascular dysfunction[J].Front Physiol，2012，132（3）：1-13.