劉建樂等

摘 要 為探討國(guó)內(nèi)割手密種質(zhì)資源的遺傳多樣性，本研究采用ISSR分子標(biāo)記對(duì)采自8省的52份割手密種質(zhì)資源進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，22條ISSR引物共擴(kuò)增出127條條帶，其中多態(tài)性條帶121條，多態(tài)率達(dá)95.3%。材料間遺傳相似系數(shù)GS在0.60～0.91之間。UPGMA聚類分析結(jié)果表明：在遺傳相似系數(shù)0.72時(shí)52份材料可分為4大類；ISSR分析結(jié)果顯示，割手密遺傳多樣性豐富，可以用ISSR對(duì)割手密進(jìn)行分子水平的鑒定和遺傳多樣性研究。

關(guān)鍵詞 割手密；遺傳多樣性；ISSR；SDS法

中圖分類號(hào) S566.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Genetic Diversity in Saccharum spontaneum L.

Based on ISSR Markers

LIU Jianle1，2， BAI Changjun1 *， YAN Linling1， YANG Hubiao1

ZHANG Long1，2， HUANG Chunqiong1

1 Tropical Crops Genetic Resources Institute， CATAS / Key Laboratory of Tropical Crops Germplasm Utilization，

Ministry of Agriculture， Danzhou， Hainan 571737， China

2 College of Agronomy， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract In order to analyze the genetic diversity of Chinese S. spontaneum L.， a toatal of 52 S. spontaneum L. was used and ISSR markers were apllied. With 22 ISSR primers， 127 loci were detected among which 121 were polymorphic， indicating considerable genetic variations at the species level.The genetic similarity among all accessions was ranged from 0.60 to 0.91. The 52 S. spontaneum L. were clustered into four groups by UPGMA when GSC was 0.72. The study indicated that ISSR produced high polymorphism on S. spontaneum L. and could be used in the study of the molecular evaluation and studies of genetic diversity of the S. spontaneum L. germplasm.

Key words Saccharum spontaneum L.； Genetic diversity； ISSR； SDS methods

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.012

割手密（Saccharum spontaneum L.），又名甜根子草，為禾本科（Gramineae）甘蔗屬（Saccharum）多年生草本植物[1]。割手密的適應(yīng)性強(qiáng)，分布范圍廣，在我國(guó)北緯18°15′～33°20′，東經(jīng)97°～122°海拔1～2 460 m的地區(qū)均有分布[2]，是當(dāng)前世界范圍內(nèi)甘蔗育種中抗逆性、分蘗性、適應(yīng)性等優(yōu)良性狀的主要來源[3]，但目前甘蔗育種面臨親本資源匱乏，品種間遺傳背景狹窄，盲目性、重復(fù)性等問題。因而從分子水平上揭示割手密遺傳資源的多樣性，確立分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)非常重要。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間（inter-simple sequence repeats，ISSR）PCR技術(shù)是1994年加拿大蒙特利爾大學(xué)的Zietikiewicze[4]提出的。其原理是在SSR的3′或5′端錨定1～4個(gè)核苷酸，進(jìn)而對(duì)反向排列的SSR間的一段DNA 進(jìn)行擴(kuò)增。該技術(shù)不僅克服了SSR和RAPD技術(shù)的某些缺點(diǎn)而且具有多態(tài)性高、重復(fù)性強(qiáng)、DNA用量少、操作簡(jiǎn)單、快速、高效等優(yōu)點(diǎn)[5]。目前該技術(shù)已應(yīng)用于甜橙[6]、扁穗牛鞭草[7]、狗牙根[8]、野牛草[9]、尤氏針茅[10]等植物種質(zhì)資源的研究，并取得了較好的成果。對(duì)于割手密，Chen等[11]通過分子聚類分析，推論出我國(guó)割手密起源于云南。楊清輝等[12]選用6個(gè)隨機(jī)引物對(duì)32份不同緯度、不同海拔、不同染色體數(shù)目的割手密作RAPD分析，結(jié)果表明，供試的32份割手密具有豐富的多態(tài)性，可劃分為9個(gè)類群。樊麗娜等[13]對(duì)廣東地區(qū)的67個(gè)割手密種質(zhì)采用Genomic-SSR和EST-SSR標(biāo)記分析，結(jié)果表明，廣東割手密之間的遺傳關(guān)系存在顯著地由南向北的地理分化，但利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)割手密種質(zhì)資源的研究尚未見報(bào)道。本研究應(yīng)用ISSR技術(shù)首次對(duì)采集的52份割手密進(jìn)行了遺傳多樣性分析，在分子水平上探討了其遺傳多樣性，旨在對(duì)割手密種質(zhì)資源的保護(hù)鑒定、利用及以后的育種工作提供必要的參考。

1 材料與方法

1.1 材料及來源

本研究材料來自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所牧草中心種質(zhì)資源圃（表1），2013年5月初齊地割掉地上部分，6月1號(hào)在每個(gè)資源圃中隨機(jī)挑選15株割手密，每株剪取幼嫩健康、無病斑的葉片若干，裝入編號(hào)袋，用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，-80 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 將SDS法改良用于提取割手密的DNA。（1）取1～2 cm葉片剪碎，放入預(yù)冷的研缽中，用液氮充分研磨成粉末，將粉末狀材料迅速轉(zhuǎn)入滅菌的2 mL離心管，加入65 ℃預(yù)熱的SDS緩沖液800 μL，顛倒離心5 min，使葉片粉末與提取液充分混合。（2）將混合液置于65 ℃的水浴中加熱1 h，每隔15 min搖動(dòng)1次。（3）將混合液放入冰盒至常溫，加入800 μL酚 ∶ 氯仿 ∶ 異戊醇（25 ∶ 24 ∶ 1），輕輕晃動(dòng)5 min。（4）4 ℃，11 000 r/min離心15 min，轉(zhuǎn)移上清液于另一滅菌離心管中。加入750 μL氯仿 ∶ 異戊醇（24 ∶ 1），輕輕晃動(dòng)5 min。（5）4 ℃，11 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液于另一滅菌管中，加入等體積-20 ℃預(yù)冷的異戊醇，輕輕晃動(dòng)5 min，-20 ℃冰箱放置1 h。（6）4 ℃，11 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入4 ℃預(yù)冷的70%乙醇500 μL，洗滌沉淀2次。將離心管置于吸水紙上，室溫風(fēng)干20 min。（7）加入100 μL TE緩沖液溶解沉淀、加入1 μL的RNAseA（10 mg/L），4 ℃保存待測(cè)。

1.2.2 ISSR引物篩選 ISSR所用引物為加拿大哥倫比亞大學(xué)（UBC）公布的100個(gè)引物序列，由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。 用 A42（廣東）、A48（海南）、A49（廣西）3份材料作為DNA模板從中篩選出22條擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性好的引物用于擴(kuò)增反應(yīng)。

用A48作為DNA模板對(duì)引物進(jìn)行退火溫度的PCR擴(kuò)增，退火溫度設(shè)為47～57 ℃，PCR儀自動(dòng)生成12個(gè)退火溫度（47.0、47.7、48.5、49.3、50.4、51.4、52.5、53.6、54.7、55.6、56.5、57.1 ℃），1%瓊脂糖凝膠中電泳，電壓120 V，電泳50 min，篩選出每個(gè)引物合適的退火溫度。

1.2.3 ISSR擴(kuò)增反應(yīng)體系 ISSR擴(kuò)增反應(yīng)體系經(jīng)過優(yōu)化后確定為20 μL，反應(yīng)體系如下：模板（100 ng/μL）1.0 μL、Taq酶（5.0 U/μL）0.5 μL、10×buffer 2.0 μL、ISSR引物（10 μmol/L）1.0 μL、dNTP（10 mmol/L）1.4 μL、MgCl2（25 mmol/L）2.0 μL、無菌水補(bǔ)足至20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性7 min；94 ℃變性30 s，47～57 ℃（按不同的引物退火溫度調(diào)整）退火45 s，72 ℃延伸2 min，45個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物在含有TBE的1%瓊脂糖凝膠中電泳，電壓120 V，電泳50 min。以2 000 bp Maker為標(biāo)準(zhǔn)分子量對(duì)照，在Gene Genius Bioimaging System凝膠成像儀上照相。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) ISSR為顯性標(biāo)記，圖譜中的每一條帶都視為1個(gè)分子標(biāo)記。對(duì)ISSR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，記錄擴(kuò)增條帶的有無，在電泳圖上，有清晰條帶的記為 1，同一位置無帶的記為 0，根據(jù)統(tǒng)計(jì)條帶的結(jié)果建立原始數(shù)據(jù)（0，1）矩陣。利用NTSYS-pc 2.1軟件，計(jì)算品種的遺傳相似系數(shù)，用UPGMA法進(jìn)行聚類分析，繪制樹狀聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性分析

從UBC公布的100條引物中篩選出22條能產(chǎn)生清晰條帶、重復(fù)性好的ISSR引物對(duì)52份種質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增，共產(chǎn)生127條大小約在100～2 500 bp的條帶（表2）。圖1顯示引物UBC 843對(duì)割手密部分材料的擴(kuò)增結(jié)果。22個(gè)引物擴(kuò)增的條帶變化為8條（UBC853和UBC892）到4條（UBC854和UBC855），平均每個(gè)引物能擴(kuò)增5.8條條帶，多態(tài)性條帶平均5.5條。在擴(kuò)增出的127個(gè)條帶中，其中121條具有多態(tài)性，多態(tài)百分率（PPL）為95.3%，表明割手密種質(zhì)資源中具有豐富的遺傳多態(tài)性，運(yùn)用ISSR標(biāo)記可以很好地揭示參試割手密種間或種內(nèi)的遺傳差異及親緣關(guān)系。

2.2 ISSR標(biāo)記的遺傳相似性分析

利用NTSYS 軟件計(jì)算52份割手密材料間的Nei-Li相似系數(shù)GS，52份割手密的遺傳相似系數(shù)在0.60～0.91之間，平均GS為0.73。從種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)可以看出（表3），在52份割手密材料中，A41和A16的遺傳相似系數(shù)最?。?.60），表明 A41和A16的親緣關(guān)系甚遠(yuǎn)，遺傳差異較大，存在較大的遺傳多樣性。A26和A13的遺傳相似系數(shù)最大（0.91），表明A26和A13的親緣關(guān)系較近，遺傳差異較小。從割手密遺傳相似性分析可知，野外采集的52份野生割手密存在較大的遺傳多樣性和種內(nèi)遺傳相似性。結(jié)果再次表明，這52份割手密種質(zhì)存在豐富的遺傳多樣性。

2.3 ISSR標(biāo)記的聚類分析

利用NTSYS-pc 2.1軟件，計(jì)算材料間的遺傳相似系數(shù)，通過UPGMA法進(jìn)行聚類分析（圖2）。在遺傳相似系數(shù)0.72時(shí)可分為四大類。第Ⅰ類包括26份種質(zhì)，是最大的一個(gè)類群，其中6份來自云南，5份來自廣東，7份來自廣西，7份來自海南，1份來自福建。其中A51和A52遺傳相似系數(shù)為0.90，說明它們的親緣關(guān)系很近。第Ⅱ類包括23份種質(zhì)，其中8份來自海南。第Ⅲ類只包括A24（廣西）1個(gè)材料。第Ⅳ類包括A15（貴州）和A16（江西）2份種質(zhì)。在遺傳相似系數(shù)0.735時(shí)可將第Ⅰ類分為兩個(gè)亞類。第一亞類包括云南的A1和A9，廣東的A3、A10和A12，海南的A7、A8、A13、A14和A18，以及廣西的A11和福建的A6。第二亞類包括云南的A4、A5、A22和A19，廣西的A17、A20、A21、A49、A50和A51，海南的A47和A48，廣東的A2和A52。從圖2可見它們之間的遺傳聚類與其地理來源沒有嚴(yán)格的一致性。

3 討論與結(jié)論

3.1 ISSR標(biāo)記

劉洪博等[14]用SSR分析云南割手密的遺傳多樣性，共擴(kuò)增出233條條帶，多態(tài)性比率為89.0%。王英等[15]采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)96份甘蔗種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，利用7條多態(tài)性較強(qiáng)的引物共擴(kuò)增出85條多態(tài)性條帶，其種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)在0.15～0.19之間。本實(shí)驗(yàn)首次采用ISSR對(duì)我國(guó)南方地區(qū)的割手密種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行分析，在擴(kuò)增出的127個(gè)條帶中，其中121條具有多態(tài)性，多態(tài)百分率（PPL）為95.3%，遺傳相似系數(shù)在0.60～0.91之間，平均GS為0.73。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)的割手密的ISSR標(biāo)記表現(xiàn)出了較高的多態(tài)性（95.3%），表明割手密種質(zhì)資源具有豐富的遺傳多態(tài)性，在分子水平上差異較大。本試驗(yàn)與以上研究結(jié)果略有差別，有差別的原因可能是研究材料和研究方法的不同造成的[16]。Prevost A只用了4個(gè)ISSR引物就將安第斯亞種的34個(gè)馬鈴薯品種分開了[17]。劉莉等[18]從50條ISSR引物中選出的7條引物均能擴(kuò)增出清晰條帶，并將20份野牛草單株區(qū)分開。本試驗(yàn)利用22條ISSR引物能夠?qū)?2份割手密材料分開，并利用UPGMA法進(jìn)行聚類將供試材料劃分為六大類。再次證實(shí)了ISSR標(biāo)記技術(shù)在割手密遺傳多樣性分析中是一種效率高、重復(fù)性好的分子標(biāo)記技術(shù)，適合割手密種質(zhì)遺傳多樣性的研究，這與王英等得出ISSR分子標(biāo)記技術(shù)用于甘蔗屬遺傳多樣性的分析是可行的結(jié)論一致[15]。

3.2 聚類分析

從供試材料間的聚類分析可以看出，52份割手密的遺傳聚類與其地理來源沒有嚴(yán)格的一致性，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能有兩個(gè)：一是地區(qū)之間存在種質(zhì)資源的交換，二是不同地方品種來源地的小生境可能存在一定的遺傳相似性。特別值得注意的是，A23（福建）與其它供試材料差異明顯，單獨(dú)為一類。與同為福建的A28并沒有聚為一類，其原因可能是地理位置導(dǎo)致了基因的變異，A23靠海邊，A28靠近山區(qū)。

本研究用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)52份割手密材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，從分子水平上驗(yàn)證了這些割手密的分類，明確了它們之間的遺傳相似性。采集的52份割手密的遺傳多樣性不僅豐富而且其遺傳關(guān)系與地理來源無嚴(yán)格一致性。因此，應(yīng)加強(qiáng)割手密種質(zhì)資源的原生境和異地保護(hù)力度，以及加大選育優(yōu)良割手密的進(jìn)度，為割手密種質(zhì)資源的保護(hù)鑒定和甘蔗的育種、能源草的選育做好準(zhǔn)備。

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責(zé)任編輯：沈德發(fā)