陳殿君 李曉松 趙輝 付艷 胡佳 祁楠 石秀麗 杜楠

作者單位：100048 北京 解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院腫瘤二科

臨床研究

半抗原DNP修飾自體腫瘤疫苗治療晚期惡性黑色素瘤的臨床研究

陳殿君 李曉松 趙輝 付艷 胡佳 祁楠 石秀麗 杜楠

作者單位：100048 北京 解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院腫瘤二科

目的 探討半抗原二硝基氟苯（dinitrophenyl，DNP）修飾自體腫瘤疫苗在晚期惡性黑色素瘤治療中的作用。方法 84例Ⅲ期或Ⅳ期可切除惡性黑色素瘤患者隨機分為半抗原DNP修飾瘤苗組和半抗原DNP未修飾瘤苗組，每組42例，分別采用半抗原DNP修飾的自體腫瘤疫苗和半抗原DNP未修飾的自體瘤苗聯(lián)合化療進行治療，采用流式細胞技術(shù)檢測兩組患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cell，Treg）數(shù)量及淋巴細胞亞群的變化，觀察遲發(fā)型超敏反應(yīng)（delayed type hypersensitivity，DTH）及隨訪生存情況。結(jié)果 治療后半抗原DNP修飾瘤苗組患者CD4+-IFN-γPE、CD8+-IFN-γPE淋巴細胞亞群較治療前及半抗原DNP未修飾瘤苗組明顯升高（P均＜0.05），而CD4+CD25+Treg數(shù)量減少（P＜0.05），半抗原DNP未修飾瘤苗組治療前后無明顯變化（P＞0.05）；半抗原DNP修飾瘤苗組患者較半抗原DNP未修飾瘤苗組DTH明顯增強，硬結(jié)明顯增大，兩組DTH達到陽性結(jié)果（≥5 mm）的百分比分別為94.6%和45.0%（P＜0.05）。半抗原DNP修飾瘤苗組患者1年、2年和3年生存率分別為95.0%、73.0%和65.5%，總生存率（overall survival，OS）為79.3%，無疾病生存率（disease free survival，DFS）為81.1%；半抗原DNP未修飾瘤苗組患者1年、2年和3年生存率分別為90.1%、59.0%和43.5%，OS為64.2%，DFS為74.0%，兩組患者生存時間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 半抗原DNP修飾的自體瘤苗可增強惡性黑色素瘤患者特異性細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，抑制機體免疫耐受，從而延長患者生存時間。

惡性黑色素瘤；二硝基氟苯；半抗原；腫瘤疫苗；免疫治療

惡性黑色素瘤（簡稱惡黑）是一種高度惡性、易轉(zhuǎn)移、預(yù)后差、對化療、放療均不敏感的惡性腫瘤，但卻是免疫原性較高的腫瘤，因此近年來腫瘤疫苗及免疫因子治療惡黑得到了廣泛應(yīng)用［1］。二硝基氟苯（dinitrophenyl，DNP）修飾自體腫瘤疫苗是治療晚期惡黑的一種新方法。DNP為經(jīng)典半抗原，可誘發(fā)機體產(chǎn)生遲發(fā)型超敏反應(yīng)（delayed type hypersensitivity，DTH）。DTH是一種過敏原誘發(fā)的T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，這些過敏原實際上起到半抗原的作用，從而可用于免疫治療。而在免疫治療過程中，調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cell，Treg）在免疫抑制反應(yīng)中扮演著主要角色。Treg細胞可通過抑制CD4+CD25-T細胞和活化的CD8+CTL細胞等效應(yīng)性T細胞的增殖［2，3］，抑制樹突狀細胞（dendritic cell，DC）的成熟和抗原遞呈能力，以及參與多種細胞因子的相互作用來抑制機體抗腫瘤的免疫反應(yīng)，從而促進了腫瘤細胞的生長和侵襲。而沉默黑色素瘤細胞中Foxp3（forkhead/winged helix transcription factor）稱叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子，可使Treg對CD4+CD25-T淋巴細胞增殖抑制的能力減弱，同時減弱抑制性細胞因子的分泌［4］,使腫瘤生長減慢。本文回顧性分析84例應(yīng)用半抗原DNP修飾自體腫瘤疫苗治療晚期惡黑患者的臨床資料，檢測外周血液中效應(yīng)性T細胞及Treg細胞的變化，觀察患者免疫功能及臨床療效。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

2009年2月至2012年3月84例曾在我院治療的Ⅲ期（Ⅲb期或Ⅲc期）或Ⅳ期可切除的惡黑患者中排除不可切除及資料不完整者。84例隨機分為半抗原DNP修飾瘤苗組和半抗原DNP未修飾瘤苗組，每組42例。兩組患者的性別、年齡、臨床分期及原發(fā)灶部位等差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。見表1。入組患者均符合以下條件：⑴病理診斷為惡黑，且免疫組化HMB45（+～++++）、S100（+～++++）；⑵肝腎功能及血常規(guī)基本正常；⑶Karnofsky評分≥60分；⑷預(yù)期生存期>3個月；⑸在每次化療后7～10 d給予疫苗皮內(nèi)注射；⑹參照WHO標準客觀評價療效；⑺所有受試者均簽署知情同意書，并報醫(yī)院倫理委員會批準，依從性好，便于隨診。

表1 半抗原DNP修飾瘤苗組和半抗原DNP未修飾瘤苗組患者臨床特征的比較（n）

1.2 材料

二硝基氟苯購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，CD8-FITC、CD4-FITC、IFN-PE單克隆抗體和異硫氰酸熒光素（FITC）均購自美國R&D公司，RPMI1640培養(yǎng)液、膠原酶和DNA酶均為Sigma產(chǎn)品，達卡巴嗪及順鉑為南京制藥廠生產(chǎn)，卡莫司汀為天津金耀氨基酸有限公司，他莫昔芬為寧波天衡制藥有限公司，注射用重組人白細胞介素-2（IL-2）購于遼寧衛(wèi)星制藥廠，干擾素α-2b（IFNα-2b）購自愛先靈寶雅制藥有限公司，F(xiàn)ACS/Calibur流式細胞儀為美國Becton-Dickinson公司生產(chǎn)，光學(xué)顯微鏡為日本Olympus公司，WD-9405B型水平搖床為北京市六一儀器廠產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 腫瘤疫苗的制備［5］手術(shù)切除的惡黑組織標本用于自體疫苗的制備。將標本放入生理鹽水中，洗滌3次，無菌層流間內(nèi)將腫塊切碎<1 mm3后，放入含有膠原酶和DNA酶的混合液中，37℃下消化2～4 h，以2 000 r/min離心20 min，收集腫瘤細胞，以Hank′s液洗滌3次，錐蟲藍拒染實驗，使活細胞達80%以上。為了確保黑色素瘤細胞后代，采用免疫染色方法，分別用兔抗-S100多克隆抗體，A-103和HMB-45單克隆抗體評估S-100、MART-1和gp100的表達，需要至少一種抗體陽性染色＞50%。分別應(yīng)用抗-HLAI類和抗-HLAII類單克隆抗體W6/32和CR3/43確定腫瘤細胞主要組織相容性復(fù)合物（major histocompatibility complex，MHC）的表達。將篩選后的細胞加入凍存劑，-80℃低溫冰箱冷凍或液氮凍存?zhèn)溆?。取凍存的細胞?7℃快速復(fù)蘇，以含10%人AB血型血清的RPMI1640培養(yǎng)液洗滌2次，懸浮于生理鹽水中，每次取細胞（1～5）×106個/ml加入6孔板中，再加0.2%DNP溶液100 μl，培養(yǎng)24 h，然后經(jīng)60Co照射30 Gy，以滅活細胞，備用。

1.3.2 化學(xué)治療 達卡巴嗪（DTIC）200 mg/m2，d1~ d4；順鉑（PDD）30 mg/m2，d1~d3；卡莫司?。˙CNU）125 mg/m2，d1~d2；他莫昔芬20 mg/m2，d1-d7。21 d重復(fù)1次為1個周期，最多行6個周期治療。生物治療以IL-2和IFNα-2b為主：IL-2 200萬～400萬單位，靜滴；IFNα-2b 300萬～600萬單位，皮下注射，以上兩藥隔日交替應(yīng)用，6～8周為1個療程。每個化療周期結(jié)束后2～4d靜脈或局部給予DC（2～5）×106個細胞，同時取1 ml瘤苗，加入卡介苗0.1 ml（50 TU/ml），在上臂三角肌處3個鄰近點皮內(nèi)注射，共注射6～8次。

1.3.3 細胞分離及檢測 分別于半抗原DNP修飾的及半抗原DNP未修飾的腫瘤疫苗治療前2 d和每次瘤苗治療后1周（共6次），采集患者外周靜脈血液（抗凝），離心分離單個核細胞，分離外周血淋巴細胞，對外周血淋巴細胞分別行CD4-FITC、CD8-FITC、IFN-γPE單抗標記，進行熒光激活細胞分選術(shù)（flurescence activated cell sorting，F(xiàn)ACS）檢測；取患者外周血加肝素抗凝，加入CD4-PE和CD25-FITC單克隆抗體，室溫避光30 min，裂解，PBS沖洗，離心5 min（1 500 r/min），棄去上清液；每份標本加入1%多聚甲醛500 μl，用流式細胞儀檢測CD4+CD25+Treg數(shù)量的變化。

1.3.4 DTH反應(yīng)的測定 為評估自體腫瘤細胞抗原的特異性DTH，分別于半抗原DNP修飾或半抗原DNP未修飾的腫瘤疫苗治療前2 d及每次瘤苗治療后1周（共6次），在患者上肢三角肌處皮內(nèi)注射瘤苗，觀察48 h后，通過觸診確定每個反應(yīng)硬塊的邊界［6］，用食指腹面觸摸邊界大小，每個邊緣用鋼筆標記，每次陽性結(jié)果之間距離用二色鋼筆檢測，直徑≥5 mm判定為陽性反應(yīng)，直徑≥15 mm為強陽性。評估對自體腫瘤細胞抗原的特異性DTH，以PPD（50 TU/m1）作為非特異性對照，測量注射后紅斑及硬結(jié)大?。╩m）。

1.4 隨訪

通過門診就診及電話或隨訪信函的方式進行隨訪。實施半抗原DNP修飾腫瘤疫苗治療的患者，每3～6個月對淺表淋巴結(jié)行B超、胸腹部CT掃描或PET檢查，了解腫瘤有無轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)。截至2013年3月，除3例患者失訪外，余81例患者均隨訪3年以上，中位隨訪時間為40個月，失訪率為3.6%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。采用Kaplan-Meier法計算生存率，兩組計量資料的比較用t檢驗，計數(shù)資料的比較用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 瘤苗治療前后惡黑患者外周血液CD8+和CD4+細胞的變化

84例Ⅲ期或Ⅳ期惡黑患者化療后聯(lián)合半抗原瘤苗治療，在治療前后，對外周血淋巴細胞分別用CD8-FITC、CD4-FITC、IFN-γPE單抗標記，并用流式細胞術(shù)檢測。結(jié)果顯示治療后半抗原DNP修飾瘤苗組患者CD4+-IFN-γPE、CD8+-IFN-γPE均較治療前及半抗原DNP未修飾瘤苗組明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）；而半抗原DNP未修飾瘤苗組患者治療前后兩者變化不顯著，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。再次驗證了經(jīng)半抗原DNP修飾瘤苗治療后，可激發(fā)機體特異性細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，與之前臨床研究結(jié)果相同［7］。

表2 惡黑患者瘤苗治療前后外周血液CD4+-IFN-γPECD8+-IFN-γPE淋巴細胞亞群的變化（±s，%）

表2 惡黑患者瘤苗治療前后外周血液CD4+-IFN-γPECD8+-IFN-γPE淋巴細胞亞群的變化（±s，%）

分別與半抗原DNP未修飾瘤苗組比較，*P均＜0.05。

組別 治療前 治療后 t P半抗原DNP修飾瘤苖組CD4+-IFN-γPE5.01±0.76 9.42±1.94*19.399 <0.05 CD8+-IFN-γPE3.88±1.51 10.22±2.93*17.628 <0.05半抗原DNP未修飾瘤苖組CD4+-IFN-γPE5.12±1.11 5.54±1.36 2.193 ＞0.05 CD8+-IFN-γPE3.61±1.23 5.43±0.89 10.987 ＞0.05

2.2 流式細胞術(shù)檢測惡黑患者治療前后外周血液CD4+CD25+Treg數(shù)量的變化

取84例中晚期惡黑患者治療前后外周血液，通過流式細胞術(shù)檢測CD4+CD25+Treg數(shù)量的變化。結(jié)果顯示半抗原DNP修飾瘤苗組患者治療后CD4+CD25+Treg數(shù)量較治療前明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而半抗原DNP未修飾瘤苗組患者治療前后變化不顯著，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

2.3 惡黑患者瘤苗治療前后DTH反應(yīng)的評估

84例Ⅲ期或Ⅳ期惡黑患者接種瘤苗治療前后，半抗原DNP修飾瘤苗組和半抗原DNP未修飾瘤苗組患者均可發(fā)生DTH反應(yīng)，但半抗原DNP修飾瘤苗組患者治療后硬結(jié)較半抗原DNP未修飾瘤苗組明顯增大，兩組達到陽性結(jié)果（≥5 mm）的百分比分別為94.6%和45.0%（P＜0.05）。與以前研究結(jié)果［7］相似，提示半抗原DNP修飾瘤苗明顯提高機體對特異性腫瘤原性反應(yīng)。見表4。

2.4 療效隨訪

在整個治療過程中，所有患者毒副反應(yīng)溫和，耐受性良好，對生活質(zhì)量影響較小，無嚴重毒性反應(yīng)發(fā)生。隨訪3年，32例患者生存時間超過36個月（目前仍健在），其中半抗原DNP修飾瘤苗組22例患者生存時間超過30個月，其中僅4例DTH陽性；半抗原DNP未修飾瘤苗組10例患者生存時間超過30個月，8例DTH陽性，其中1例因肺轉(zhuǎn)移、2例因肝轉(zhuǎn)移和2例因腦轉(zhuǎn)移而死亡。半抗原DNP修飾瘤苗組患者1年、2年、3年生存率分別為95.0%、73.0%和65.5%，總生存率（overall survival rete，OS）為79.3%，無疾病生存率（disease free survival，DFS）為81.1%；半抗原DNP未修飾瘤苗組患者1年、2年、3年生存率分別為90.1%、59.0%和43.5%，OS為64.2%，DFS為74.0%，兩組患者生存時間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1、圖2。

表3 惡黑患者瘤苗治療前后外周血液CD4+CD25+Treg數(shù)量的變化（±s，%）

表3 惡黑患者瘤苗治療前后外周血液CD4+CD25+Treg數(shù)量的變化（±s，%）

組別 治療前 治療后 t P半抗原DNP修飾瘤苗組 52.51±2.98 25.55±2.33 -65.321 <0.05半抗原DNP未修飾瘤苗組 50.61±3.00 45.38±2.6 -11.995 ＞0.05

表4 惡黑患者瘤苗治療前后DTH反應(yīng)的比較（±s）

表4 惡黑患者瘤苗治療前后DTH反應(yīng)的比較（±s）

與半抗原DNP未修飾瘤苗組比較，χ2=9.224，*P＜0.05。

硬結(jié)直徑（mm）組別 硬結(jié)陽性率（%）治療前 治療后半抗原DNP修飾瘤苗組 6.5±0.8 22.1±2.4 94.6*半抗原DNP未修飾瘤苗組 5.0±1.2 10.4±1.9 45.0

圖1 84例惡黑患者總生存率的曲線

圖2 84例惡黑患者無疾病生存率的曲線

3 討論

惡性黑色素瘤為高度惡性腫瘤，病死率較高，Ⅲ期及Ⅳ期惡黑患者預(yù)后極差。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（Ⅲ期）2年總生存率為29%~38%，中位無疾病生存期為12個月，有遠處轉(zhuǎn)移者生存期更短。進展期患者中位生存期僅2～8個月，5年生存率不足5%［8］。目前對該腫瘤系統(tǒng)性化療的認識并不一致，有報道結(jié)合白細胞介素-2、干擾素和化療制劑可以產(chǎn)生高達64%的反應(yīng)率，然而轉(zhuǎn)移性惡黑的系統(tǒng)性治療結(jié)果仍然令人失望，目前的化療方案不能明顯提高中位生存期，對于大多數(shù)單一藥物的臨床反應(yīng)率低于15%。在前瞻性隨機試驗中沒有證據(jù)表明其他化學(xué)藥物治療更優(yōu)于達卡巴嗪。因此需要改變治療策略來提高轉(zhuǎn)移性惡黑患者的預(yù)后。

DTH是一種過敏原誘發(fā)的T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，這些過敏原實際上起到半抗原的作用。DNP等是最早用于研究接觸性DTH的經(jīng)典的半抗原，其具有原發(fā)性、刺激性及較強抗原性。在正常皮膚上易被吸收，對于正常人群與在細胞免疫正常情況下，都可誘發(fā)皮膚遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。故可以測定人體的細胞免疫力，同時多次誘發(fā)此種變態(tài)反應(yīng)，可增強人體的細胞免疫力。Manne等［9］研究發(fā)現(xiàn)DNP半抗原與MHC附著的多肽（抗原）相結(jié)合對于形成免疫原性是非常重要的步驟。由于腫瘤抗原分子表達許多分子，DNP修飾的細胞將產(chǎn)生大量半抗原誘發(fā)的蛋白，經(jīng)過APC（包括DC）加工，與MHCⅠ類和Ⅱ類分子形成復(fù)合物，在細胞表面產(chǎn)生巨大的溝槽，大大增加了與T細胞反應(yīng)的結(jié)合位點。因此，半抗原系統(tǒng)能夠有效地誘發(fā)腫瘤特異性免疫反應(yīng)。2007年Terheyden等［10］用二硝基氯苯（dinitrochlorobenzene，DNCB）致接觸性皮炎聯(lián)合化療藥物DTIC治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤，結(jié)果顯示Ⅲ期患者（n=39）的客觀反應(yīng)率為62%，而Ⅳ期患者（n=33）的客觀反應(yīng)率僅為9%，有趣的是，無論處于疾病的哪個階段，一半以上的患者保持疾病無進展超過1年，提示DNCB聯(lián)合DTIC對于不適合手術(shù)或肢體分離灌注的區(qū)域轉(zhuǎn)移的惡性黑色素瘤患者有效。Ridolfi等［11］應(yīng)用DCs疫苗誘發(fā)DTH對27例Ⅳ期惡黑患者進行研究，DTH陽性患者（19例）的中位生存期為22.9個月，DTH陰性患者的中位生存期為4.8個月，總中位生存期為16個月，該結(jié)果顯示DTH陽性率與提高生存期呈高度相關(guān)性。有研究認為［12］，皮膚DTH可以作為該免疫療法的觀察指標。

本研究通過分析84例曾在我院治療的Ⅲ期（Ⅲb期或Ⅲc期）或Ⅳ期可切除惡黑患者臨床資料，探討半抗原DNP修飾自體腫瘤疫苗在晚期惡性黑色素瘤治療中的作用。治療后分析發(fā)現(xiàn)，半抗原DNP修飾瘤苗組患者CD4+-IFN-γPE、CD8+-IFN-γPE淋巴細胞亞群較治療前及未修飾瘤苗組明顯升高（P＜0.05），且DTH反應(yīng)強度與CD8+-IFN-γPE雙陽性細胞比例的升高呈現(xiàn)一致性［13］。半抗原DNP修飾瘤苗組患者外周血液中CD4+CD25+Treg數(shù)量較治療前及未修飾瘤苗組有所減少（P＜0.05）。Treg是目前公認的調(diào)節(jié)人體免疫耐受的細胞，在免疫抑制反應(yīng)中扮演著主要角色，對維持機體免疫耐受和免疫應(yīng)答穩(wěn)態(tài)具有非常重要的意義。雖然目前對上述結(jié)果的機制尚未明確，但可能與患者免疫力增強而免疫耐受作用相對減弱有關(guān)。半抗原DNP修飾瘤苗組患者的OS及DFS明顯優(yōu)于半抗原DNP未修飾瘤苗組。其結(jié)果與我科先前的研究［7］相似，再次證明DNP修飾的自體腫瘤疫苗對增強宿主特異性遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)、活化抗原提呈細胞、增強CTL活性，從而引起強大的免疫反應(yīng)抑制免疫耐受的形成有重要作用。因此，惡黑患者經(jīng)半抗原DNP修飾的身體腫瘤疫苗治療可使特異性細胞免疫功能增強，可能在殺滅殘留癌細胞、阻抑腫瘤復(fù)發(fā)和提高遠期療效有一定作用，有望成為治療惡黑患者的重要手段。

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［2014-04-23收稿］［2014-08-02修回］［編輯 阮萃才］

Clinical study of dinitrophenyl-modified autologous tumor vaccine to treat advanced malignant melanoma

CHEN Dian-jun，LI Xiao-song，ZHAO Hui，F(xiàn)U Yan，HU Jia，QI Nan，SHI Xiu-li，DU Nan（The Second Department of Oncology，The First Affiliated Hospital of Chinese PLA General Hospital，Beijing 100048，P.R.China）

DU Nan.E-mail：dunan05@aliyun.com

Objective To investigate the efficacy of autologous tumor vaccine modified to carry the dinitrophenyl hapten to treat advanced malignant melanoma.Methods Clinical data were retrospectively analyzed for 84 patients who underwent resection for stageⅢb，Ⅲc or IV malignant melanomas.Patients were divided into two groups depending on whether or not their biochemotherapy was supplemented with dinitrophenyl-modified autologous tumor vaccine.The two groups were compared in terms of the following parameters：relative numbers of CD4+CD25+regulatory T cells and lymphocyte subsets in peripheral blood，which were determined using flow cytometry；observed strength of delayed type hypersensitivity（DTH）；and clinical outcomes such as overall survival（OS）and disease-free survival（DFS）.Results The subpopulations of CD4+-IFN-γPEand CD8+-IFN-γPElymphocytes were significantly larger in the vaccinated patients than in the biochemotherapy-only patients（P<0.05），while the relative proportions of CD4+CD25+regulatory Tcells were significantly smaller（P<0.05）.DTH-positive response（defined as spot size≥5 mm）occurred in 94.6%of vaccinated patients but in only 45%of biochemotherapy-only patients（P<0.05）.The 1-，2-and 3-year survival rate were 95.0%，73.0 and 65.5%in the vaccinated group,respectively，90.1%，59.0%and 43.5%in the biochemotherapy-only group,respectively.OS and DFS in the vaccinated group were 79.3%and 81.1%，compared to 64.2%and 81.1%in the biochemotherapy-only group.The difference in OS between the two groups was significant（P<0.05）.Conclusion Administering autologous tumor vaccine modified with the dinitrophenyl hapten may increase the overall survival of patients with specific cell-mediated melanoma，and it appears to do so by enhancing their immune response and inhibiting immune tolerance.

Melanoma；Dinitrophenyl；Hapten；Tumor vaccine；Immunotherapy

R739.5

A

1674-5671（2014）03-06

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.03.06

國家自然科學(xué)基金資助青年項目（NO.81000994）；首都臨床特色應(yīng)用研究課題（Z131107002213040）

杜楠。E-mail：dunan05@aliyun.com