謝學(xué)成邱海湯帆葛蓮英覃宇周作者單位：5300 南寧 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胃腸外科；廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院；廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院內(nèi)鏡室

臨床研究

端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

謝學(xué)成1邱海1湯帆1葛蓮英2覃宇周
作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胃腸外科；1廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院；2廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院內(nèi)鏡室

目的 探討端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）在結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）和相應(yīng)正常組織中mRNA的表達(dá)，分析hTERT mRNA與結(jié)直腸癌患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系。方法 以實時熒光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）法檢測42例結(jié)直腸癌組織及其相應(yīng)正常組織中hTERT mRNA的表達(dá)，分析其與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，并結(jié)合臨床隨訪資料分析其與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果 hTERT mRNA在結(jié)直腸癌組織和正常組織均可表達(dá)，但結(jié)直腸癌組織中hTERT mRNA的表達(dá)水平明顯高于相應(yīng)正常組織，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.011）；在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌中hTERT mRNA高表達(dá)率比無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌明顯增高（92.0%vs 52.9%，P=0.011）；在結(jié)直腸癌臨床TNMⅢ期/Ⅳ期中hTERT mRNA的高表達(dá)率明顯高于Ⅰ期/Ⅱ期（92.3%vs 50.0%，P=0.006）。通過Kaplan-Meier分析，結(jié)直腸癌患者h(yuǎn)TERT mRNA的低表達(dá)組和高表達(dá)組之間的生存曲線差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.014），提示hTERT mRNA的高表達(dá)可能與預(yù)后不良相關(guān)。結(jié)論 hTERT不僅在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，而且可能促進(jìn)結(jié)直腸癌的浸潤、轉(zhuǎn)移，有望成為結(jié)直腸癌的預(yù)后標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。

結(jié)直腸腫瘤；端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶；預(yù)后；實時熒光定量PCR

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）發(fā)病率位居全世界所有惡性腫瘤的第三位，死亡率位居第四位，每年大約新增120萬例患者，超過600 000人死亡［1］。目前普遍認(rèn)為，影響CRC患者預(yù)后的主要因素為腫瘤浸潤?quán)徑鞴?、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。研究表明，端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）在腫瘤的發(fā)生和浸潤、轉(zhuǎn)移中起重要作用，包括結(jié)直腸癌［2］。近年來研究發(fā)現(xiàn)hTERT mRNA在胃癌、子宮頸癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤中的表達(dá)均呈不同程度升高，但hTERT的表達(dá)與CRC患者臨床病理參數(shù)，比如分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期等之間的關(guān)系尚存在分歧［3~8］。此外，國內(nèi)關(guān)于結(jié)直腸癌hTERT表達(dá)的研究存在一些不足之處，盡管蛋白水平的檢測對于基因功能的研究優(yōu)于轉(zhuǎn)錄水平，但關(guān)于hTERT的研究大部分集中在采用免疫組化半定量方法檢測蛋白水平，較少針對組織基因mRNA層次，且mRNA檢測方法多采用常規(guī)RT-PCR法。因此，本課題采用目前驗證基因mRNA的表達(dá)更為可靠、敏感的實時熒光定量PCR（quantitative realtime polymerase chain reaction，qRT-PCR）法［9］對結(jié)直腸癌組織中hTERT mRNA的表達(dá)進(jìn)行研究，結(jié)合臨床病理參數(shù)及隨訪資料進(jìn)行分析，進(jìn)一步明確hTERT與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 一般資料

收集廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2007年至2010年42例結(jié)直腸癌手術(shù)切除標(biāo)本，其中男24例，女18例，平均年齡59歲，所有病例術(shù)前均未經(jīng)化療、放療或免疫治療，術(shù)后均經(jīng)病理檢查證實。結(jié)直腸癌組織和相應(yīng)的正常組織（距離腫瘤10 cm以外），獲取標(biāo)本后一部分立即置于液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)至-80℃超低溫冰箱保存，另一部分以10%福爾馬林固定，用于病理診斷。所有病例均經(jīng)書信或電話隨訪，截止日期為2014年7月1日。

1.2 主要試劑和儀器

總RNA提取試劑盒為德國Qiagen公司，cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實時熒光定量PCR試劑盒為美國Thermo Scientific公司。hTERT基因上游引物為5′-CTCCCATTTCATCAGCAAGTTT-3′，下游引物為5′-CTTGGCTTTCAGGATGGAGTAG-3′；內(nèi)參GAPDH基因上游引物為5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物為5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′（由Invitrogen公司合成）。實時熒光定量PCR儀為安捷倫Mx3005P。

1.3 方法

1.3.1 總 RNA提取 根據(jù) Qiagen MiRNeasy Mini Kit試劑盒說明書，從結(jié)直腸癌新鮮冰凍組織中提取總RNA，以1%的瓊脂糖變性凝膠電泳檢測RNA的完整性，Nanodrop2000檢測總RNA的質(zhì)量濃度和純度，選擇OD260/280在1.8~2.1之間的樣品進(jìn)行下一步逆轉(zhuǎn)錄實驗。

1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄實驗 按照Thermo Scientific的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，選擇oligo（dT）18引物逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，反應(yīng)條件如下：65℃5 min，冰浴2 min，42℃60 min，70℃5 min。

1.3.3 實時熒光定量PCR檢測 按照Thermo Scientific SYBR Green qPCR Kit的說明書結(jié)合預(yù)實驗，PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)為95℃7 min，90℃10 s，60℃30 s，40個循環(huán)，結(jié)直腸癌組織和配對正常組織同時檢測目的基因hTERT和內(nèi)參基因GAPDH，每個樣品做3個復(fù)孔。hTERT mRNA的相對表達(dá)水平RQ=2-△△Ct，以RQ>1表示hTERT mRNA的表達(dá)升高，RQ<1表示hTERT mRNA的表達(dá)降低。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)分析軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料的比較采用兩個獨(dú)立樣本t檢驗，計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗或者連續(xù)校正χ2檢驗；應(yīng)用Kaplan-Meier分析繪制生存曲線，并采用log-rank檢驗比較兩組生存曲線間的差異性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR檢測結(jié)直腸癌組織及配對正常組織hTERT mRNA的表達(dá)情況

hTERT及內(nèi)參GAPDH均為典型S型擴(kuò)增曲線，溶解曲線呈單峰且溶解溫度均一，沒有產(chǎn)生明顯的引物二聚體，表明引物特異性好，qRT-PCR檢測結(jié)果可靠。見圖1（A、B）。分析數(shù)據(jù)顯示hTERT mRNA在結(jié)直腸癌組織和正常組織均可表達(dá)，但相對于正常組織，結(jié)直腸癌組織中hTERT mRNA的表達(dá)水平明顯上調(diào)（P=0.011），其中，42例標(biāo)本中10例hTERT mRNA在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)下調(diào)（RQ<1），32例表達(dá)上調(diào)（RQ>1），高表達(dá)率為76.19%。見圖2（A、B）。

圖1 hTERT、GAPDH實時熒光定量PCR檢測的結(jié)果

圖2 qRT-PCR檢測結(jié)直腸癌組織中hTERT mRNA表達(dá)的結(jié)果

2.2 hTERT mRNA的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理參數(shù)間的關(guān)系

在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌中hTERT mRNA的高表達(dá)率比無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌明顯增高（92.0%vs 52.9%，P=0.011）；在結(jié)直腸癌臨床 TNMⅢ期/Ⅳ期中hTERTmRNA的高表達(dá)率明顯高于Ⅰ期/Ⅱ期（92.3%vs 50.9%，P=0.006），而hTERT mRNA的高表達(dá)與患者年齡、腫瘤大小、分化程度、腫瘤部位及浸潤深度和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移之間均無關(guān)（P均>0.05）。見表1。

表1 hTERT mRNA的表達(dá)情況與結(jié)直腸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系［n（%）］

2.3 hTERT mRNA的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者總生存時間的關(guān)系

將42例患者根據(jù)臨床隨訪所獲得的信息進(jìn)行生存分析，隨訪日期截至2014年7月1日，其中13例患者健在，27例死亡，2例失訪，隨訪率為95.3%，通過log-rank檢驗發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者h(yuǎn)TERT mRNA高表達(dá)組與低表達(dá)組之間總生存期生存曲線的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.014），hTERT mRNA的高表達(dá)提示較低的總生存時間（高表達(dá)組和低表達(dá)組患者的總生存時間中位數(shù)分別是50個月和79個月）。見圖3。觀察表明hTERT mRNA的高表達(dá)可能降低結(jié)直腸癌患者的總生存率。

圖3 hTERT mRNA的高表達(dá)組與低表達(dá)組之間結(jié)直腸癌患者的生存曲線比較

3 討論

結(jié)直腸癌是全世界危害程度較高的惡性腫瘤之一，其致死率占所有癌癥死亡的9%，早期結(jié)直腸癌經(jīng)外科手術(shù)治療后5年生存率接近85%，然而在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的Ⅲ期結(jié)直腸癌患者，其5年生存率則不足50%［10］。因此早期、準(zhǔn)確地診斷腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移對于改善患者的治療及預(yù)后十分關(guān)鍵。近年來，端粒、端粒酶與腫瘤關(guān)系的研究越來越引起人們重視，hTERT是維持端粒酶活性的核心成分和限速步驟，其表達(dá)可以準(zhǔn)確地測量端粒酶的活性［11］。在大多數(shù)類型腫瘤中，異常的細(xì)胞增殖和癌變都需要hTERT參與，包括結(jié)直腸癌［2］。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)hTERT在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平呈不同程度上調(diào)，但hTERT的表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)和預(yù)后之間的關(guān)系尚存在分歧。Izgi等［5］通過qPCR檢測發(fā)現(xiàn)hTERT在癌組織和正常組織均表達(dá)，但癌組織中hTERT mRNA的表達(dá)是正常組織的4.33倍（P<0.001），且hTERT的表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床分期、腫瘤部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Saleh等［6］研究發(fā)現(xiàn)hTERT mRNA的表達(dá)與腫瘤的浸潤深度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度均無關(guān)，但相比于右半結(jié)腸癌，左半結(jié)腸癌和直腸癌中hTERT的表達(dá)水平更高（P=0.029）。魏曉軍等［7］采用T7 RNA聚合酶催化的熒光擴(kuò)增技術(shù)（Cellular FACTT）檢測結(jié)直腸癌患者外周血液循環(huán)腫瘤細(xì)胞中hTERT的表達(dá)與臨床病理的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)hTERT陽性檢出率與TNM分期、M分期及腫瘤分化程度具有相關(guān)性（P<0.05）。而彭玉林等［8］通過qRT-PCR檢測結(jié)直腸癌外周血液hTERT mRNA的表達(dá)，證明結(jié)直腸癌組hTERT的表達(dá)水平和陽性率均明顯高于健康對照組（P<0.05），hTERT的表達(dá)與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)（P<0.05），而與腫瘤發(fā)生部位、腫瘤大小和分化程度無相關(guān)性（P＞0.05）。

本課題采用qRT-PCR技術(shù)檢測結(jié)直腸癌中hTERT mRNA的表達(dá)，qRT-PCR是一項新的技術(shù)，其敏感性和特異性均較高，且不像常規(guī)RT-PCR法需要電泳處理，避免了電泳過程中的誤差，也克服了免疫組化和PCR等法只能進(jìn)行定性分析的缺點(diǎn)，使實驗結(jié)果可信度更高。

本研究結(jié)果表明hTERT mRNA在結(jié)直腸癌組織和正常組織均可表達(dá)，但結(jié)直腸癌組織中hTERT mRNA的表達(dá)水平明顯高于正常組織（P=0.011）。hTERT mRNA的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.011）及TNM分期（P=0.006）密切相關(guān)，而與患者年齡、腫瘤大小、分化程度、腫瘤部位、浸潤深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等無關(guān)，表明hTERT的表達(dá)水平隨著結(jié)直腸癌患者疾病的嚴(yán)重程度的升高而增加。近年來關(guān)于hTERT與腫瘤預(yù)后的關(guān)系亦有報道，Gertler等［12］首先報道結(jié)直腸癌中hTERT的高表達(dá)預(yù)示患者預(yù)后較差。而Zaffaroni等［13］研究提示任何端粒酶維持機(jī)制的缺失都可能促成較為良好的預(yù)后。最近研究［14］表明，端粒酶可以作為結(jié)直腸癌患者總生存期獨(dú)立的預(yù)后評價指標(biāo)之一。本課題結(jié)合臨床隨訪資料，通過Kaplan-Meier繪制生存曲線比較hTERT高表達(dá)組、低表達(dá)組之間的差異，經(jīng)log-rank檢驗顯示兩曲線間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.014），表明結(jié)直腸癌患者中hTERT的高表達(dá)提示其術(shù)后生存期較短。但目前對其機(jī)制仍未十分清楚。有研究［15］發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染hTERT不僅可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，還可以增強(qiáng)癌細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)的黏附能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移。最近研究［16］表明hTERT與癌癥轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的主要因素上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）及癌癥干細(xì)胞關(guān)系密切，hTERT過表達(dá)能促進(jìn)EMT和誘導(dǎo)癌細(xì)胞干性，從而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，而hTERT表達(dá)的小分子感染RNA消耗，則可以減少轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β1）和β-catenin介導(dǎo)的EMT。

綜上所述，hTERT在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)較相應(yīng)正常組織明顯升高，并與結(jié)直腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及術(shù)后生存時間密切相關(guān)，進(jìn)一步明確了hTERT在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中起到重要作用。hTERT有望作為結(jié)直腸癌患者預(yù)后評估的一個指標(biāo)之一，hTERT表達(dá)升高的結(jié)直腸癌患者應(yīng)加強(qiáng)隨訪。

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［2014-08-11收稿］［2014-09-02修回］［編輯 阮萃才］

Clinical and prognostic significance of hTERT expression in patients with colorectal cancer

XIE Xue-cheng1，QIU Hai1，TANG Fan1，GE Lian-ying2，QIN Yu-zhou（Department of Gastrointestinal Oncology，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University；1Graduate School of Guangxi Medical University；2Department of Endoscopy，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China）

QIN Yu-zhou.E-mail：qyz402@126.com

Objective To investigate the expression profile of human telomerase reverse transcriptase（hTERT）in colorectal cancer（CRC）and to assess its clinical significance.Methods Quantitative real-time PCR was used to detect expression of hTERT mRNA both in colorectal cancer and in corresponding normal tissue.Expression data were correlated with clinicopathological features，and survival analysis was performed to assess the prognostic significance.Results The hTERT mRNA was expressed in both tumor and CRC tissue，but it was expressed at significantly higher levels in cancer tissue（P=0.011）.Upregulation of hTERT was significantly associated with lymph node involvement（P=0.011）and TNM stage（P=0.006）.Kaplan-Meier survival analysis of low vs.high expressers of hTERT revealed much lower survival among high expressers（P=0.014）.Conclusions The results of the current study suggest that hTERT may play an important role in onset of CRC，so the protein may have potential as a prognostic biomarker or even as a therapeutic target.

Colorectal neoplasm；hTERT；Prognosis；Quantitative real-time polymerase chain reaction

R735.3+5

A

1674-5671（2014）03-06

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.03.07

廣西教育廳科研基金資助項目（201012MS038）

覃宇周。E-mail：qyz402@126.com