龐聰，田厚文

中國疾病預防控制中心 病毒病預防控制所病毒病應急技術中心，北京 102206

痘苗病毒曾在人類消除天花的戰(zhàn)役中起到關鍵作用，此后，它作為一種基因轉移載體，被廣泛用于針對多種感染性疾病，如艾滋病、流感、天花、瘧疾、結核等，以及許多腫瘤，如黑色素瘤、非小細胞型肺癌、腎細胞癌、前列腺癌、直腸結腸癌、人乳頭瘤病毒（HPV）相關宮頸癌、乳腺癌等的基因工程重組疫苗的研究[1]。為了提高痘苗病毒載體的安全性，科學家們又發(fā)展出了非復制型痘苗病毒或復制缺陷型痘苗病毒，它們是對痘苗病毒進行自然或基因工程減毒得到的在非允許細胞中無法有效復制的病毒株。非復制型痘苗病毒具備痘苗病毒的主要優(yōu)點：①多種細胞嗜性；②可插入大的基因片段（至少25 kb）[2]；③痘苗病毒載體疫苗不需要進行蛋白純化，可在短時間內大量生產，因此可以作為預防生物恐怖的儲備疫苗。另外，近年來腫瘤治療已從傳統的手術療法、放射療法、化學療法跨入免疫療法時代，這促進了人們去研究如何利用病毒載體激發(fā)機體的免疫反應，以利用機體自身的免疫系統來對抗腫瘤。于是，非復制型病毒載體作為腫瘤的治療性疫苗紛紛進入臨床前和臨床研究[1]?？傊?，以非復制型痘苗病毒為載體的重組疫苗在反恐和腫瘤治療等領域具有廣闊的應用前景。

在該領域，目前國際上主要應用的是改良痘苗病毒安卡拉株（modified vaccinia Ankara，MVA）和NYVAC；而國內具有代表性的是本實驗室具有自主知識產權的復制缺陷型痘苗病毒天壇株（NTV）。MVA是將土耳其的一株天花疫苗株痘苗病毒安卡拉株在雞胚成纖維細胞（CEF）中自然傳代500次，丟失了15%的基因，包括免疫逃避和宿主范圍相關基因形成的病毒株[3]；NYVAC為痘苗病毒哥本哈根株（vaccinia virus Copenhagen，VACV-Cop）的衍生株，它在后者基礎上用基因工程技術人工刪除了18個開放讀框，包括宿主范圍、毒力和致病性相關基因[4]；NTV是從我國用于天花預防接種的疫苗株痘苗病毒天壇株基因組中用基因工程技術人工選擇去除了與宿主范圍和毒力相關的26個基因，總長21 243個核苷酸，獲得的復制缺陷型天壇株痘苗病毒[5]。

國際上，基于MVA和NYVAC的載體疫苗已大量進入臨床研究[1]。為了發(fā)展基于我國具有自主知識產權的NTV載體疫苗，為未來針對各種感染性疾病和腫瘤的NTV重組疫苗的臨床研究奠定理論和實驗基礎，有必要了解和比較NTV、MVA和NYVAC等非復制型痘苗病毒的生物學性狀，明確痘苗病毒相關基因功能與生物學性狀的關系。故我們擬從以下幾方面對MVA、NYVAC和NTV生物學性狀的現有研究資料進行總結和比較，為深入研究我國非復制型痘苗病毒天壇株的生物學性狀提供參考。

1 基因組結構

作為痘病毒科脊椎動物痘病毒亞科正痘病毒屬的一員，痘苗病毒的基因組為線狀雙鏈DNA結構。不同毒株之間的基因組大小略有差異，大體為180～200 kb。與痘病毒科其他成員相同，痘苗病毒基因組的中央通常為保守區(qū)，基因高度保守，編碼必要的與病毒復制相關的蛋白；而兩側通常為非保守區(qū)，基因變異較大，編碼與宿主范圍等相關的蛋白。

圖1 MVA、NYVAC和NTV的基因組結構示意圖以VACV-Cop為參考，顯示MVA、NYVAC和NTV各自缺失的基因；MVA和NYVAC的示意圖來自文獻［1］，NTV示意圖參考文獻［5，11］繪制，其中C1L～C19L、N1L、N2L、M1L、M2L、K1L～K3L為構建NTV時人工缺失（21.2 kb），其余基因是原痘苗病毒天壇株與VACV-Cop的天然差異

MVA、NYVAC和NTV各自的基因組結構見圖1。其中，一個宿主范圍基因C7L僅存在于MVA，而不存在于NYVAC和NTV；另一個宿主范圍基因K1L在三者中都被缺失或破壞。有研究表明，C7L的功能與病毒晚期蛋白正確合成的控制和凋亡相關[6]，而C7L和K1L都能抑制蛋白激酶（PKR）的活性[6-9]，并抑制Ⅰ型干擾素引發(fā)的抗病毒活性[10]。可以推測，一些重要基因的存在或缺失是導致3株病毒生物學性狀差異的重要原因。

2 體外生長特性

病毒的體外生長特性，如細胞嗜性，可以反映病毒細胞水平的宿主范圍。判斷病毒細胞嗜性的依據通常是，來自特異的組織或物種的細胞培養(yǎng)物是否能夠允許、半允許或不允許某種病毒在其中完成復制，病毒能在其中躲避宿主防御而成功復制的細胞即是該病毒的允許細胞。參與決定和影響病毒細胞嗜性的基因通常稱為病毒的宿主范圍基因（host range gene）[12]。

根據現有資料，我國的復制缺陷型痘苗病毒天壇株在允許細胞CEF上繁殖良好且能有效傳代；在非允許細胞2BS（人胚肺細胞）上不能繁殖和傳代，在143TK-（人骨髓瘤細胞）上只能產生極低滴度的子代病毒，且在這2種人源非允許細胞上均不能形成與原痘苗病毒天壇株一樣的典型病毒噬斑[5]。

一項關于MVA和NYVAC的比較性研究報道，在允許細胞BHK-21中，MVA和NYVAC的滴度與野生型痘苗病毒WR株（Western Reserve strain）基本持平，而在非允許細胞HeLa細胞中，前二者的滴度未升高而WR的滴度升高1萬倍。該研究還發(fā)現，無論在允許細胞BHK-21還是在非允許細胞HeLa（人源）、BSC-40（猴源）和3T3（鼠源）細胞中，NYVAC都比MVA形成的細胞病變更嚴重。有趣的是，在感染BHK-21后，NYVAC的細胞結合型病毒滴度低于MVA和WR，鑒于僅NYVAC感染的細胞在晚期有凋亡跡象，提示我們該降低可能是NYVAC引起的嚴重細胞破壞的結果[13]。

3種病毒的細胞嗜性總結如表1?？梢钥闯觯鼈冊贑EF和幼地鼠腎細胞BHK-21中能夠有效復制，在人源細胞中均不能有效復制。

3 病毒復制和形態(tài)發(fā)生

不同于其他DNA病毒，痘病毒在靶細胞的胞漿中復制。病毒基因表達受一種級聯機制嚴格調控，一般病毒感染后早期基因立即利用感染的毒粒中的酶和轉錄因子開始轉錄，而中期和晚期基因在病毒DNA復制后才開始轉錄[12,15-16]。病毒粒子的組裝是一個很復雜的過程，涉及幾種病毒形態(tài)：在病毒進入之后，早期基因轉錄導致許多與宿主細胞相互作用的分子和病毒DNA合成的分子表達，該過程發(fā)生于被粗面內質網包圍的核旁工廠區(qū)，或者叫復制中心；中期和晚期基因，包括結構蛋白、酶和早期轉錄因子隨后被轉錄。病毒DNA被包入未成熟病毒粒子（im?mature virion，IV），它隨后成熟為感染性的胞內成熟病毒粒子（intracellular mature virion，MV），后者代表病毒生命周期中成熟的第一種感染性顆粒；一些MV被高爾基體的雙層膜包裹形成胞內包膜病毒粒子（intracellular enveloped virion，WV）；在細胞表面，WV與宿主細胞膜融合，失去外層膜，形成細胞結合型包膜病毒粒子（cell-associated enveloped vi?rion，CEV）；CEV直接與細胞膜分離或通過誘導肌動蛋白多聚化而從含有肌動蛋白的微絨毛末梢脫離，最終形成胞外包膜病毒粒子（extracellular envel?oped virion，EV）[17]。雖然已了解 MVA、NYVAC 和NTV都失去了在人細胞和大多數哺乳動物細胞中復制和形成感染性病毒粒子的能力，但在三者中造成這種結果的具體機制各不相同。

含有C7L而K1L缺失的MVA的復制缺陷可能是由于病毒粒子包裝的阻斷。研究表明，MVA在HeLa細胞中的生活周期在感染后晚期被阻斷，此時由于病毒粒子包裝的阻斷僅有4%的MV形成，但早期和晚期病毒蛋白可以產生如同在允許細胞中一樣產生[18-20]。至于其機制，報告稱在人和鼠細胞中病毒宿主范圍因子C7或K1對MVA晚期基因的表達是必不可少的[7]。具體來說，痘苗病毒感染可以引起真核翻譯起始因子2α（eIF2α）的磷酸化，從而抑制細胞和病毒蛋白合成，而痘苗病毒已進化出對抗這種抗病毒反應的能力。該研究揭示，在MVA感染的幾種人和鼠細胞系中，宿主范圍基因K1L和C7L均能抑制eIF2α的磷酸化，而C7L刪除的MVA（MVA-ΔC7L）缺乏晚期基因的表達，且這一現象可被宿主范圍因子K1或C7的功能拯救。

表1 MVA、NYVAC和NTV的對幾種細胞的嗜性

C7L和K1L均缺失的NYVAC的復制缺陷可能是由于晚期病毒蛋白合成的抑制。一項關于MVA和NYVAC在非允許和允許培養(yǎng)細胞中同等條件下的對比研究顯示，以5 PFU/細胞的MVA或NYVAC感染HeLa細胞16 h后的電鏡照片上，NYVAC感染的細胞胞漿中IV的數量明顯少于MVA感染的細胞，說明NYVAC形態(tài)發(fā)生的阻斷同時或先于IV的形成，即在NYVAC感染的細胞中存在翻譯阻斷[6]。其機制是翻譯起始因子eIF2α磷酸化水平的升高影響了某些病毒粒子成熟需要的晚期病毒蛋白的合成，也可能與NYVAC在感染的HeLa細胞中引發(fā)的強有力的凋亡有關。

此外，關于MVA和NYVAC的基因表達譜的比較性研究通過對超過15 000個人類基因進行cDNA微陣列掃描發(fā)現，在MVA和NYVAC感染的HeLa細胞中，宿主基因的表達有差異[21-22]，可能也會影響病毒成熟的程度。

初步研究表明NTV在具有復制缺陷特點的同時，保留了與原天壇株痘苗病毒相近的DNA復制、RNA轉錄和蛋白表達能力[5]。具體來說，痘苗病毒P11晚期啟動子下的乙肝病毒SS1基因的表達水平在NTV重組病毒（VHFIL2ΔCKSS1）和原復制型天壇株重組病毒（VHFIL2SS1）之間均無明顯差別。至于NTV具體在生活周期的哪一步受阻，尚未見相關報道。非常有趣的是，NTV中C7L和K1L基因均缺失，卻能完成P11晚期啟動子下的外源基因表達，似乎與上述MVA的研究結果不一致。

4 病毒在組織中的分布

觀察病毒是否可以在特異性的組織或器官中復制和擴散，可以反映病毒的組織或器官嗜性，進而決定病毒是否能在特定種屬中傳播并產生致病性。影響病毒組織嗜性的因素包括影響細胞嗜性的因子（如宿主范圍基因）和組織特異性的抗病毒免疫反應，這些因素共同決定病毒在特定組織或器官中的擴散能力和分布[12]。與具有完全復制能力的痘苗病毒WR株相比，MVA、NYVAC和NTV減毒株不能在大多數哺乳動物細胞中產生子代病毒，因此，明確這些病毒在體內的分布和病毒編碼基因在不同組織中表達的動力學特點非常重要。

痘病毒，特別是痘苗病毒，可通過幾種方式在宿主中傳播，即通過肌動蛋白直接在細胞間傳播、作為自由的病毒傳播、感染白細胞和/或通過病毒誘導的細胞運動傳播。其中，MV和EV是2種最主要的感染病毒形式，MV在數量上占絕對優(yōu)勢（＞EV100倍），對病毒在細胞內的增殖起重要作用，但MV形式僅在晚期細胞死亡和包膜破裂后才能傳播到遠處，而EV則介導病毒的細胞間擴散和遠程感染，因而對病毒體內的感染和增殖起重要作用。WV和CEV是介于MV和EV之間的另2種中間形式的病毒，它們對EV的形成至關重要。此外，CEV可以通過細胞和細胞的接觸而直接感染臨近細胞，因而對病毒在接觸細胞中的擴散起重要作用[13,23-26]。

一項關于MVA和NYVAC的體內比較性研究通過生物發(fā)光成像法和生化分析測定重組病毒表達的螢光素酶基因[27]。該研究表明，與WR相比，MVA和NYVAC感染細胞中熒光信號的表達都很短暫，表明它們在體內受限復制的特性；二者在腹膜內接種后都能到達并感染接種部位以外的靶組織；2種載體表達的異種抗原在NYVAC感染后比MVA感染后在小鼠體內持續(xù)時間長；但是，在感染后短期內MVA比NYVAC的基因表達效率高，推測這種差異并不是由于病毒吸附，而是由病毒進入后發(fā)生的時間造成。另一項最近的恒河猴實驗表明，霧化和放射標記的表達HIV和HPV抗原的重組MVA和NYVAC抗原產生至少長達6個月的安全和成功的針對外源抗原的免疫應答。另外，對恒河猴模型的閃爍掃描成像結果顯示，病毒可被肺和呼吸道的黏膜組織吸收，卻不會感染腦和眼。這些研究提示，全身和黏膜途徑是MVA和NYVAC安全高效的免疫接種途徑[28]。

一項最新的小鼠活體成像法研究NTV的組織分布發(fā)現，肌肉和皮內途徑感染的NTV-Fluc均局限分布于感染部位，未出現擴散轉移現象[29]。

5 病毒-宿主細胞間的相互作用

盡管MVA、NYVAC和NTV載體有能夠產生與具有完全復制能力的痘苗病毒相同水平的重組抗原以及通過全身和黏膜途徑誘發(fā)對抗多種感染性疾病的有效的特異性免疫反應的能力[3,5,30-36]，僅有少數研究在相同條件下對比了基于這些毒株的重組體引發(fā)的免疫反應。

研究表明，表達HIV-1抗原的MVA和NYVAC可誘發(fā)強有力的針對外源抗原的細胞免疫反應，但這種反應的廣度和寬度因痘病毒載體不同而異，還受方法和所用動物模型的影響[37-38]。在NTV、MVA和NYVAC減毒株的產生過程中，一些免疫調節(jié)基因被刪除或被破壞，這或許能夠解釋為何三者的復制雖然受到限制，但卻保留了較好的免疫原性。MVA比NYVAC丟失了更多的免疫調節(jié)基因，這與二者在體內誘導出炎癥反應的時機和強度一致。比如，MVA比NYVAC傳播和誘導抗病毒反應要快，但也被快速清除（48 h后），然而NYVAC載體可誘發(fā)延遲的抗病毒反應，且在感染動物組織中保持的時間比MVA長24 h[27]。另一項更深入的MVA和NYVAC載體的比較研究表明，MVA載體在誘導CD4+T細胞反應的同時，更傾向于誘導特異性CD8+T細胞反應，而NYVAC載體比MVA更能促進CD4+T細胞反應[39]。這些發(fā)現強調了MVA和NYVAC引發(fā)的細胞反應的差異，而這些差異可能會影響疫苗的效力。MVA和NYVAC之間的另一個顯著區(qū)別是感染不成熟的人單核細胞來源的樹突細胞（mDC）后調節(jié)宿主免疫反應的能力[40]。與未感染的mDC相比，這些載體對于宿主基因的表達有很大的影響：二者都能上調195個相同的基因，同時MVA還上調另外359個基因，而NYVAC上調另外165個基因。在mRNA水平，雖然二者都上調IL-12、IFN-β和TNF-α，但它們被MVA上調的水平更高，且MVA感染會選擇性地誘導Ⅰ型干擾素、IL-6和Toll樣受體通路。值得注意的是，在NYVAC感染的mDC中，CD8+T細胞刺激基因顯著降低。另外，NYVAC在體內更長期的基因表達可能會影響載體誘導CD4+T細胞反應的傾向，因為有報道說，推動這個T細胞亞群的克隆擴增和分化需要在整個細胞擴增期都有抗原持續(xù)存在[41]。

關于NTV的相關研究不多。有報道說，NTV疫苗免疫小鼠后能檢測到高水平的IFN-γ分泌，并能引起小鼠外周血中性粒細胞數、淋巴細胞數和白細胞總數增加，脾臟重量增加，還能引起注射部位肌肉、骨神經及肌肉的炎性細胞浸潤和纖維組織增生及腹股溝淋巴結生發(fā)中心易染體巨噬細胞增多[42]。

6 結語

以上介紹了NTV、MVA和NYVAC的幾個主要生物學性狀。不難發(fā)現，目前關于非復制型痘苗病毒MVA和NYVAC的生物學性狀的比較性研究較為深入，而關于我國NTV的生物學性狀的研究較少，然而對這些病毒生物學性狀的探討對于今后基于這些病毒的重組疫苗的開發(fā)有重要意義。比如，研究NYVAC的體外生長特性發(fā)現，NYVAC感染后的細胞在晚期有凋亡的跡象，可能對病毒的復制和形態(tài)發(fā)生有重要影響，及它會影響NYVAC晚期蛋白翻譯和隨后IV的形成。換言之，影響作為抗原的病毒晚期蛋白的表達，同時影響宿主細胞MHC分子的表達，進而影響抗原呈遞效率，這可能對基于NYVAC的重組疫苗特別是腫瘤疫苗誘發(fā)有效的免疫反應十分不利。另一個例子，研究MVA、NYVAC和NTV感染細胞的細胞病變效應時發(fā)現，這些病毒產生的細胞病變效應明顯弱于具有完全復制能力的毒株，從安全性的角度講這是有利的，但在腫瘤治療性疫苗的研究中，病毒感染后破壞宿主細胞會促進腫瘤抗原的釋放，因此，可能需要研究如何克服腫瘤抗原釋放問題的方法。第三個例子是通過研究以不同途徑接種的MVA和NYVAC在組織中的分布情況，可以找到安全有效的接種途徑，事實上，還能進一步對動物模型中的給藥劑量、誘發(fā)的免疫反應類型和持續(xù)時間進行探索。第四個例子是發(fā)現MVA傾向于促進CD8+T細胞反應，我們就可以根據不同類型疫苗（比如預防性疫苗和治療性疫苗）研發(fā)的需要選擇合適的載體。

關于NTV的生物學性狀在很多方面還有大量的工作可以做，比如NTV的體外生長特性的研究，NTV的復制和形態(tài)發(fā)生的研究（包括NTV的晚期病毒蛋白表達機制以及與C7L和K1L的關系，NTV具體在生活周期的哪一步被阻斷），通過人工選擇突變研究NTV的生物學性狀與可能對應的功能基因的關系，NTV與其他非復制型痘苗病毒在組織中分布的比較，以及NTV和宿主細胞的相互作用誘發(fā)的免疫反應和機理的研究等。正如前言中所說，以非復制型痘苗病毒為載體的重組疫苗在反恐和腫瘤治療等領域具有廣闊的應用前景，我們相信，對NTV生物學性狀的深入研究必定會促進基于NTV的針對多種感染性疾病和多種腫瘤的重組疫苗研發(fā)。

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