張 金，尹 健，張斯棋，馮樹(shù)強(qiáng)，李然偉＊

（1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科，吉林長(zhǎng)春130041；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院血管外科，吉林長(zhǎng)春130033；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院腎病內(nèi)科，吉林長(zhǎng)春130033）

外源性表達(dá)VEGF165b對(duì)人膀胱癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)影響的研究

張 金1，尹 健2，張斯棋3，馮樹(shù)強(qiáng)1，李然偉1＊

（1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科，吉林長(zhǎng)春130041；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院血管外科，吉林長(zhǎng)春130033；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院腎病內(nèi)科，吉林長(zhǎng)春130033）

目的 建立人膀胱癌T24細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，探討外源性表達(dá)VEGF165b對(duì)其生長(zhǎng)的影響及其機(jī)制。方法 分別移植未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染VEGF165b表達(dá)載體的人膀胱癌T24細(xì)胞到裸鼠膀胱內(nèi)，28d使處死動(dòng)物，稱(chēng)量腫瘤重量，測(cè)定腫瘤體積。Western blot法檢測(cè)腫瘤VEGF165b、p－VEGFR2、AKT、p－AKT蛋白表達(dá)。結(jié)果 轉(zhuǎn)染pcDNA－VEGF165b組腫瘤重量和體積與未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染pcDNA3.0組相比明顯降低（P＜0.05），而未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染pcDNA3.0組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。Western blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA－VEGF165b組與未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染pcDNA3.0組比較，VEGF165b表達(dá)增高，p－VEGFR2、p－AKT表達(dá)降低，而未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染pcDNA3.0組間無(wú)明顯差異。結(jié)論 外源性表達(dá)VEGF165b可通過(guò)抑制VEGFR2信號(hào)通路傳導(dǎo)而明顯抑制人膀胱癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)。

膀胱癌；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165b；腫瘤侵襲

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1066）

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是目前已知最重要的促血管生長(zhǎng)因子。大量研究證實(shí)，在生理和病理?xiàng)l件下，VEGF基因和蛋白的表達(dá)與血管生成息息相關(guān)。因此研究證實(shí)血管生成和VEGF表達(dá)在膀胱移行細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展和復(fù)發(fā)過(guò)程中起重要作用［1］。VEGF由于mRNA剪接方式不同可形成多個(gè)變構(gòu)體，其中最為重要的VEGF165可通過(guò)自分泌的方式刺激腫瘤細(xì)胞向惡性表型進(jìn)展，而新發(fā)現(xiàn)的VEGF變構(gòu)體VEGF165b可拮抗VEGF165，具有抗血管生成作用和抑制腫瘤功能［2］。本研究采用分子克隆與轉(zhuǎn)染技術(shù)，觀察外源性表達(dá)VEGF165b對(duì)荷瘤裸鼠人膀胱癌原位模型腫瘤生長(zhǎng)的影響并探討其作用機(jī)制，為臨床膀胱癌綜合治療提供新的理論基礎(chǔ)和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 BALB／cASlac－nu小鼠，6周齡，雌雄各45只，平均體重18g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司；人膀胱癌T24細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所。

1.2 方法

①VEGF165b表達(dá)載體構(gòu)建：提取T24細(xì)胞總RNA。按照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物克隆VEGF165b全長(zhǎng)［3］，連接到pcDNA3.0表達(dá)載體中，進(jìn)行測(cè)序鑒定，VEGF165b表達(dá)載體構(gòu)建成功（簡(jiǎn)稱(chēng)pcDNAVEGF165b）。②細(xì)胞轉(zhuǎn)染：T24細(xì)胞生長(zhǎng)融合率達(dá)90%，按照脂質(zhì)體2000說(shuō)明書(shū)分別將pcDNA3.0和pcDNA－VEGF165b表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到T24細(xì)胞中。72h后用含G418（400μg／ml）培養(yǎng)液培養(yǎng)，每3－5d換液1次。10－14d獲得陽(yáng)性細(xì)胞克隆，消化后種于96孔板中（1個(gè)細(xì)胞／孔），用含G418（200 μg／ml）培養(yǎng)液培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。③細(xì)胞移植：按照我們之前文章報(bào)道方法［4］，麻醉小鼠，無(wú)菌條件下將HCl（0.1mol／L）100μl注入膀胱，后用KOH（0.1mol／L）100μl中和，磷酸鹽緩沖液沖洗。然后分別將未轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染pcDNA3.0和pcDNAVEGF165b表達(dá)載體的T24細(xì)胞（1.5×106個(gè)）注入膀胱，保留5h。④Western blot：收集細(xì)胞離心后加入500μl 4℃預(yù)冷的RIPA緩沖液（含有蛋白酶抑制劑）提取總蛋白，用Bioford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度?？偟鞍咨蠘?0μg，聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，PVDF膜取出后封閉，一抗4℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育1－2h，DAB顯色，膜拍照記錄；結(jié)果Tanon－1600figure gel成像系統(tǒng)成像。⑤統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示。單變量配對(duì)資料之間的比較采用ANOVA法比較，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外源性表達(dá)VEGF165b對(duì)人膀胱癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響 細(xì)胞移植后第28天時(shí)處死動(dòng)物，未轉(zhuǎn)染組成瘤率為90.00%（27／30），轉(zhuǎn)染pcDNA3.0組成瘤率為93.33%（28／30），轉(zhuǎn)染pcDNAVEGF165b組成瘤率為90.00%（27／30）。取腫瘤稱(chēng)重，測(cè)量并計(jì)算瘤體積。未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染pcDNA3.0組動(dòng)物腫瘤重量為（1.8±0.4）g、（1.7± 0.3）g，體積為（1467±301）mm3、（1382±298）mm3，兩組瘤重和瘤體積比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；轉(zhuǎn)染pcDNA－VEGF165b組動(dòng)物腫瘤重量為（1.0± 0.2）g，體積為（763±201）mm3，與未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染pcDNA3.0組相比明顯降低（P＜0.05），提示外源性表達(dá)VEGF165b對(duì)人膀胱癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)有明顯抑制作用。

2.2 外源性表達(dá)VEGF165b對(duì)人膀胱癌裸鼠移植瘤VEGF165b、p－VEGFR2蛋白表達(dá) Western blot結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染pcDNA3.0組腫瘤組織中VEGF165b低表達(dá)，p－VEGFR2高表達(dá)，兩組無(wú)明顯差異；而轉(zhuǎn)染pcDNA－VEGF165b組與未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染pcDNA3.0組比較，VEGF165b表達(dá)增高，p－VEGFR2表達(dá)降低（見(jiàn)圖1）。

圖1 Western blot分析VEGF165b蛋白表達(dá)水平

2.3 外源性表達(dá)VEGF165b對(duì)人膀胱癌裸鼠移植瘤AKT、p－AKT蛋白表達(dá) Western blot結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染pcDNA3.0組腫瘤組織中p－AKT表達(dá)無(wú)明顯差異；而轉(zhuǎn)染pcDNA－VEGF165b組與未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染pcDNA3.0組比較，p－AKT表達(dá)明顯降低（見(jiàn)圖2）。

圖2 Western blot分析Akt、p－AKT蛋白表達(dá)水平

3 討論

在多種腫瘤中，VEGF的表達(dá)可作為獨(dú)立的患者存活和復(fù)發(fā)的預(yù)后指標(biāo)。VEGF基因轉(zhuǎn)錄后，由于mRNA剪切形式不同形成促血管生成和抗血管生成的兩類(lèi)亞型。在促血管生成亞型中，VEGF165和VEGF121發(fā)揮主要作用［5］。VEGFR蛋白在多種人類(lèi)腫瘤包括膀胱癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肺癌、前列腺癌等中廣泛表達(dá)，并在腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲中發(fā)揮關(guān)鍵作用［6］。VEGF165即是通過(guò)與VEGFR結(jié)合激活其下游信號(hào)傳導(dǎo)通路，刺激腫瘤細(xì)胞向惡性表型進(jìn)展。VEGF165b作為腫瘤血管生成的抑制因子，可以拮抗VEGF165，與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（VEGFR）結(jié)合，導(dǎo)致下游信號(hào)傳導(dǎo)通路抑制［7］。到目前為止，還未有關(guān)于VEGF165b對(duì)于膀胱癌生長(zhǎng)影響的體內(nèi)研究報(bào)道，因此本文針對(duì)外源性表達(dá)VEGF165b對(duì)人膀胱癌T24細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響進(jìn)行了研究。

我們之前的研究結(jié)果表明采用細(xì)胞移植方法建立的人膀胱癌裸鼠原位模型與人類(lèi)膀胱癌的發(fā)生過(guò)程和生物學(xué)行為類(lèi)似，相較于非原位模型可更好地模擬膀胱癌的生物學(xué)行為，也更適用于新的抗癌治療效果的評(píng)價(jià)［4］。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pcDNA3.0組動(dòng)物腫瘤重量和體積與未轉(zhuǎn)染組無(wú)明顯差異，但轉(zhuǎn)染pcDNA－VEGF165b表達(dá)載體的T24細(xì)胞移植組動(dòng)物腫瘤重量和體積與前兩組相比明顯降低，提示外源性表達(dá)VEGF165b對(duì)人膀胱癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)有明顯抑制作用。但三組動(dòng)物腫瘤成瘤率沒(méi)有明顯差異。

VEGF165b主要通過(guò)拮抗VEGF165與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（VEGFR）結(jié)合，導(dǎo)致下游信號(hào)傳導(dǎo)通路抑制發(fā)揮腫瘤血管生成抑制作用［7］。因此，本研究檢測(cè)了VEGFR信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA3.0組動(dòng)物腫瘤組織中VEGF165b、p－VEGFR2、p－AKT表達(dá)與未轉(zhuǎn)染組相比無(wú)明顯差異。而轉(zhuǎn)染pcDNA－VEGF165b表達(dá)載體的T24細(xì)胞移植組動(dòng)物動(dòng)物腫瘤組織中VEGF165b表達(dá)明顯增高，表明外源性表達(dá)VEGF165b成功；而p－VEGFR2表達(dá)降低，提示高表達(dá)VEGF165b可有效抑制VEGFR2活化；p－AKT表達(dá)降低，進(jìn)一步說(shuō)明VEGFR2信號(hào)通路被抑制。上述結(jié)果表明，VEGF165b拮抗VEGFR2信號(hào)通路的活化在外源性表達(dá)VEGF165b抑制人膀胱癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用。

研究顯示VEGF165b在不同組織中的表達(dá)有所不同，膀胱組織中有VEGF165b的表達(dá)［7］。VEGF165b廣泛存在于多種腫瘤和組織中，也極可能參與了膀胱移行細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)控環(huán)節(jié)。綜上，我們的研究顯示外源性表達(dá)VEGF165b具有抑制人膀胱癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的作用，而其拮抗VEGFR2信號(hào)通路的活化是重要原因之一，因此，VEGF165b可成為膀胱癌抗腫瘤治療的新基因靶點(diǎn)。

［1］Henriquez－Hernandez LA，Navarro P，Luzardo OP，et al.Polymorphisms of glutathione S－transferase mu and theta，MDR1and VEGF genes as risk factors of bladder cancer：a case－control study［J］.Urol Oncol，2012，30（5）：660.

［2］Biselli－Chicote PM，Oliveira AR，Pavarino EC，et al.VEGF gene alternative splicing：pro－and anti－angiogenic isoforms in cancer［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2012，138（3）：363.

［3］Bates DO，Cui TG，Doughty JM，et al.VEGF165b，an inhibitory splice variant of vascular endothelial growth factor，is down－regulated in renal cell carcinoma［J］.Cancer Res，2002，62（14）：4123.

［4］Perrot－Applanat M，VEGF isoforms［J］.Cell Adh Migr，2012，6（6）：526.

［5］Sitohy B，Nagy JADvorak HF，Anti－VEGF／VEGFR therapy for cancer：reassessing the target［J］.Cancer Res，2012，72（8）：1909.

［6］Woolard J，Wang WY，Bevan HS，et al.VEGF165b，an inhibitory vascular endothelial growth factor splice variant：mechanism of action，in vivo effect on angiogenesis and endogenous protein expression［J］.Cancer Res，2004，64（21）：7822.

［7］Rennel E，Waine E，Guan H，et al.The endogenous anti－angiogenic VEGF isoform，VEGF165binhibits human tumour growth in mice［J］.Br J Cancer，2008，98（7）：1250.

Effects of Exogenous VEGF165b on Nude Mice Model of Bladder Cancer in Situ

ZHANG Jin1，YIN Jian2，ZHANG Si－qi3，et al.
（1.Department of Urinary Surgery，The Second Hospital，Jilin University，Changchun130041，China；2.Department of Vascular Surgery，China－Japan Union Hospital，Jilin University，Changchun130033，China；3.Department of nephrology，China－Japan Union Hospital，Jilin University，Changchun130033，China）

Objective Establish the transplantation tumor model of human bladder cancer T24cells in nude mice and explore the exogenous expression of VEGF165bon its growth and its mechanism.Methods Human bladder cancer T24cells were transplant into bladders of nude mice.The mice were killed in 28dafter transplantation.Western blot was used to confirm the protein expression of VEGF165b、p－VEGFR2、AKT、p－AKT.Results Compared with untreated group and pcDNA3.0group，the weight and volume of tumor tissue were decreased in pcDNA－VEGF165bgroup（P＜0.05）.But there was no significant difference between untreated group and pcDNA3.0group（P＞0.05）.The protein expressions indicate that compared with untreated group and pcDNA3.0group，VEGF165bwas increased；p－VEGFR2and p－AKT were decreased.But there was no significant difference between untreated group and pcDNA3.0 group.Conclusion Exogenous expression of VEGF165bsuppresses signaling pathway of VEGFR2and inhibits the growth of nude mice model of bladder cancer.

Bladder cancer；VEGF165b，tumor invasion

Q786

A

張金，男，吉林大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科研究生。

2013－11－15）

1007－4287（2014）07－1066－03

吉林省自然科學(xué)基金（200905139）

＊通訊作者