董進(jìn)浪，李 華，汪 健，王小中，胡曉彥，曾林祥

（1.煙臺(tái)市萊陽(yáng)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東萊陽(yáng)265000；2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院，江西南昌330006）

細(xì)菌性肺炎快速診斷基因芯片的初步構(gòu)建

董進(jìn)浪1，李 華2＊，汪 健2，王小中2，胡曉彥2，曾林祥2

（1.煙臺(tái)市萊陽(yáng)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東萊陽(yáng)265000；2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院，江西南昌330006）

目的 根據(jù)細(xì)菌16SrRNA基因特點(diǎn)設(shè)計(jì)常見病原菌的特異性探針，采用酶顯色技術(shù)構(gòu)建基因芯片，探討其臨床應(yīng)用的可能性。方法 選取肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌及銅綠假單胞菌等8種細(xì)菌性肺炎常見的病原菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株作為研究對(duì)象，并選擇12份患者的痰液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。在16SrRNA基因保守區(qū)設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)的通用引物及革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌的通用探針，利用可變區(qū)的差異設(shè)計(jì)合成特異性探針，構(gòu)建基因芯片。利用細(xì)菌16S rRNA基因設(shè)計(jì)的PCR通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，所有8種細(xì)菌均獲得350bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。以地高辛標(biāo)記特異性探針，構(gòu)建完成可用于8種常見病原菌檢測(cè)的基因芯片，結(jié)果 8種標(biāo)準(zhǔn)菌株基因芯片檢測(cè)均取得了預(yù)期效果，對(duì)12份痰標(biāo)本中常規(guī)培養(yǎng)陽(yáng)性7份，其對(duì)應(yīng)芯片檢測(cè)結(jié)果均成陽(yáng)性，5份常規(guī)培養(yǎng)陰性的標(biāo)本中，芯片結(jié)果提示陽(yáng)性的有3份，其中1份為嗜肺軍團(tuán)菌，2份為使用抗生素后的患者標(biāo)本。結(jié)論 設(shè)計(jì)合成的PCR通用引物對(duì)擴(kuò)增細(xì)菌的16SrRNA基因具有較高的特異性及靈敏度。構(gòu)建的基因芯片可用于常見細(xì)菌性肺炎病原菌的檢測(cè)鑒定，且對(duì)抗生素使用后的臨床標(biāo)本及苛養(yǎng)菌有一定的診斷價(jià)值。本研究所獲得基因芯片對(duì)于細(xì)菌性肺炎的檢測(cè)具有簡(jiǎn)單、快速、特異性及敏感性高的特點(diǎn)。

16SrRNA；基因芯片；細(xì)菌性肺炎

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1048）

細(xì)菌性肺炎是威脅人類健康的一種重要疾病，發(fā)病率和死亡率均較高。目前細(xì)菌性肺炎的病原學(xué)診斷主要依靠細(xì)菌培養(yǎng)或免疫學(xué)檢測(cè)等方法。細(xì)菌培養(yǎng)用于病原學(xué)診斷存在許多不足：培養(yǎng)至少需要2－3天，并且患者在使用抗生素后易出現(xiàn)假陰性，若培養(yǎng)基中混有生長(zhǎng)迅速的污染菌，往往會(huì)影響病原菌的分離；免疫學(xué)檢測(cè)方法是通過(guò)檢測(cè)血清中的特異性抗原、抗體或觀察雙份血清標(biāo)本抗體滴度的變化，判斷病原體感染，由于部分抗體形成較晚，免疫學(xué)檢測(cè)方法常用于回顧性診斷，不建議作為確診依據(jù)［12］。尋找更為快速、簡(jiǎn)便、實(shí)用的病原學(xué)檢測(cè)方法是臨床發(fā)展的需要。本研究根據(jù)細(xì)菌16SrRNA基因的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)建立一種基因芯片，擬解決細(xì)菌性肺炎快速診斷病原菌的問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 選擇8種細(xì)菌性肺炎常見病原菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株：肺炎鏈球菌（ATCC 31001），金黃色葡萄球菌（ATCC 25923），大腸埃希菌（ATCC 25922），流感嗜血桿菌（ATCC 33391），肺炎克雷伯菌（ATCC 46114），鮑曼不動(dòng)桿菌（ATCC 25285），銅綠假單胞菌（ATCC 27853）和嗜肺軍團(tuán)菌（ATCC 33152）作為研究對(duì)象，同時(shí)選擇12份呼吸道感染并且經(jīng)痰液涂片革蘭染色符合細(xì)菌培養(yǎng)要求的痰液標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)。

1.2 芯片構(gòu)建與檢測(cè) 試劑盒DIG DNA標(biāo)記試劑盒Ⅰ（DDLK－010）、地高辛雜交檢測(cè)試劑盒Ⅰ（DIGD－110）、Hyb高效雜交液均購(gòu)自深圳依諾金生物科技有限公司。

1.3 細(xì)菌性肺炎常見病原菌的檢測(cè) 所有實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》（第三版）進(jìn)行［3］。細(xì)菌鑒定根據(jù)菌落特點(diǎn)和革蘭染色及觸酶、氧化酶等試驗(yàn)上機(jī)鑒定（VITEK－32，法國(guó)生物梅里埃），藥敏試驗(yàn)應(yīng)用瓊脂稀釋法對(duì)病原菌進(jìn)行MIC（mg／L）測(cè)定，判斷結(jié)果參照臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）2010年版標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

1.4 嗜肺軍團(tuán)菌抗體IgM檢測(cè) 間接免疫熒光法檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌抗體IgM，試劑盒來(lái)自德國(guó)歐蒙醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)有限公司。檢測(cè)特異性IgM類抗體前，需去除樣本中的IgG類抗體。

1.5 細(xì)菌DNA的提取 采用煮沸法提取細(xì)菌DNA：50μl生理鹽水，挑取1－2個(gè)血平板上過(guò)夜培養(yǎng)的菌落，加入50μl DNA裂解液，混勻，100℃煮沸10min，12 000rpm離心5min，吸取上清液置－20℃儲(chǔ)存。

1.6 16S rRNA基因PCR擴(kuò)增

1.6.1 引物探針的設(shè)計(jì)合成 從GenBank及Ribosomal Database Project－Release 10數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索8種病原菌的16SrRNA全序列（patial，1 300bp以上），每個(gè)菌種選取10個(gè)不同型別的sequence文件。將以上80個(gè)sequence文件轉(zhuǎn)換成DNAStar格式，導(dǎo)入DNAStar程序的SeqManⅡ模塊進(jìn)行序列比較分析，確定細(xì)菌的高度保守區(qū)和各病原菌的相對(duì)特異區(qū)。將設(shè)計(jì)好的候選引物和探針輸入Ribosomal Database Project－Release 10數(shù)據(jù)庫(kù)中在線分析，驗(yàn)證其特異性和敏感性。

1.6.2 PCR擴(kuò)增 將提取好的細(xì)菌DNA樣品在20μl反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。PCR條件：94℃初變性30s，52℃退火45s，72℃延伸60s，進(jìn)行30－35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min。取出PCR擴(kuò)增產(chǎn)物備用。

1.7 基因芯片的制備

1.7.1 探針的合成和修飾 設(shè)計(jì)好的探針由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，探針在5’端氨基修飾加T至400bp大小，以便固定于NC膜上。

1.7.2 芯片點(diǎn)樣 20×SSC中將NC膜預(yù)濕，室溫干燥后備用，依次將探針及對(duì)照點(diǎn)樣于NC膜上（0.5CM間隔）待干。置60℃烤箱中干烤固定2h備用。

1.8 芯片雜交及檢測(cè)

1.8.1 預(yù)雜交 將制備好的NC膜置于無(wú)菌離心管中，加入5ml高效雜交液，將雜交儀設(shè)定為65℃，8－15rpm預(yù)雜交1－2h。

1.8.2 雜交 ①地高辛標(biāo)記PCR產(chǎn)物的變性處理：將標(biāo)記好的PCR產(chǎn)物放100℃煮10min，立即放冰浴冷卻10min。②將雜交管取出，倒出預(yù)雜交液，另取適量的高效雜交液5－10ml，加入變性過(guò)的地高辛標(biāo)記PCR產(chǎn)物1－3μl／膜，或5－20ng／ml高效雜交液，混勻。加入到雜交管中，雜交儀設(shè)定為65℃，8－15rpm雜交4h。

1.8.3 酶聯(lián)顯色 ①將雜交和嚴(yán)謹(jǐn)洗滌后的NC膜在洗滌緩沖液中浸潤(rùn)1－5min。②在30ml阻斷液中孵育30min。③在10ml抗體液中孵育30分鐘。④在30ml洗滌液洗滌2×15min。⑤在15ml檢測(cè)緩沖液中平衡2－5min。⑥加入10ml顯色底物液避光反應(yīng)15min，勿搖動(dòng)。⑦用50ml雙蒸水或TE－緩沖液漂洗NC膜5min終止反應(yīng)。肉眼觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 引物與探針設(shè)計(jì)

經(jīng)SeqManⅡ聚類分析，80個(gè)16SrRNA基因全序列總長(zhǎng)1 656bp，共有區(qū)域?yàn)榈?0－1540bp。選擇839－890區(qū)，1177－1217區(qū)設(shè)計(jì)通用引物；中間891－1176的多色區(qū)域?yàn)榭勺儏^(qū)，用于設(shè)計(jì)革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌及各病原菌的特異性探針，如圖1。

在Ribosomal Database Project－Release 10數(shù)據(jù)庫(kù)中分別驗(yàn)證各病原菌探針的特異性和敏感性，特別關(guān)注每種菌中我們預(yù)選的8株菌的序列是否包含在其中，以及是否存在非特異菌種及其引起肺炎的可能性。

2.2 PCR反應(yīng)條件優(yōu)化及產(chǎn)物驗(yàn)證

2.2.1 梯度PCR（大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922）：上游引物Sense：5’AGCAAACAG GATTAGATACC 3’，Tm：53.7℃；下游引物Anti－Sense：5’CGGGACTTAACCCAACAT3’，Tm：55.02℃。退火溫度梯度設(shè)置為：52℃52.3℃53.2℃54.4℃55.8℃57.3℃，退火溫度為52℃時(shí)，條帶最純最亮，如圖2。

2.2.2 7種病原菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)CR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖3（52℃退火）。金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25923在DNA模板量加倍后PCR，以大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC25922）DNA模板原量做對(duì)照，結(jié)果如圖4。

圖1 SeqManⅡ聚類分析839－1217區(qū)保守序列與可變序列分布情況

圖2 大腸埃希菌ATCC25922梯度PCR產(chǎn)物電泳

圖3 7種病原菌標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)CR產(chǎn)物電泳

圖4 金黃色葡萄球菌DNA模板量加倍后PCR產(chǎn)物電泳

2.2.3 大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC25922）PCR產(chǎn)物測(cè)序，委托六合華大基因科技股份有限公司（訂單編號(hào)W100906－0791－004）。ATCC25922序列與PUBMED序列的比對(duì)結(jié)果（如圖4）顯示，PCR擴(kuò)增成功，上下游引物設(shè)計(jì)達(dá)到預(yù)期要求。

2.2.4 地高辛標(biāo)記PCR產(chǎn)物 地高辛標(biāo)記PCR產(chǎn)物電泳，被標(biāo)記的片段較小，肉眼觀察標(biāo)記前后的泳動(dòng)位置差別不大。按照l(shuí)oading buffer（6×）1μl＋5μl DIG PCR產(chǎn)物電泳，條帶比較亮。地高辛標(biāo)記PCR產(chǎn)物的標(biāo)記效率檢測(cè)（NC膜上顯色）地高辛標(biāo)記PCR產(chǎn)物在NC膜上可進(jìn)行特異的雜交，效率與酶標(biāo)陽(yáng)性對(duì)照效率相當(dāng)，如圖5，6。

2.3 基因芯片的雜交結(jié)果

地高辛標(biāo)記PCR產(chǎn)物雜交檢測(cè)芯片酶聯(lián)顯色結(jié)果，見圖7，8。構(gòu)建的基因芯片用于8種常見細(xì)菌性肺炎致病菌的檢測(cè)鑒定，均獲得了特異性的斑點(diǎn)。

圖5 地高辛標(biāo)記PCR產(chǎn)物電泳驗(yàn)證

圖6 地高辛標(biāo)記PCR產(chǎn)物的標(biāo)記效率

圖7 芯片探針點(diǎn)樣示意圖

2.4 12份痰標(biāo)本細(xì)菌培養(yǎng)與芯片檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

在12份痰標(biāo)本中常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性7份，其對(duì)應(yīng)芯片檢測(cè)結(jié)果均成陽(yáng)性，5份常規(guī)培養(yǎng)陰性的標(biāo)本中，芯片結(jié)果提示陽(yáng)性的有3份，其中1份為嗜肺軍團(tuán)菌，2份為使用抗生素后的患者標(biāo)本，見表1。

3 討論

細(xì)菌性肺炎是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，發(fā)病率和死亡率均較高，早期病原學(xué)診斷對(duì)于合理選擇抗生素，減少細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生及其引起的經(jīng)濟(jì)損失，縮短患者住院時(shí)間，降低患者死亡率，具有重要意義。傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)是病原學(xué)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但費(fèi)時(shí)長(zhǎng)且陽(yáng)性率低。

通過(guò)回顧性調(diào)查，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，本文篩選出了細(xì)菌性肺炎常見的8種病原菌：肺炎鏈球菌，流感嗜血桿菌，肺炎克雷伯菌，金黃色葡萄球菌，嗜肺軍團(tuán)菌（間接免疫熒光法檢測(cè)IgM抗體），大腸埃希菌，銅綠假單胞菌及鮑曼不動(dòng)桿菌，占細(xì)菌性肺炎病原菌菌種分布的90%以上［4－5］。近年來(lái)，肺炎支原體、肺炎衣原體及真菌感染在病原體肺炎中的比例呈上升趨勢(shì)，因其引物探針選擇區(qū)域及PCR條件與細(xì)菌不同，未納入本研究范圍。

通過(guò)DNAStar軟件中SeqmanⅡ模塊的聚類分析，本課題篩選出在細(xì)菌16SrRNA基因高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)通用引物，在相對(duì)保守區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)革蘭陽(yáng)性菌探針和革蘭陰性菌探針，在高度可變區(qū)設(shè)計(jì)8種常見病原菌的特異性探針，并經(jīng)Ribosomal Database Project－Release 10數(shù)據(jù)庫(kù)信息比較驗(yàn)證。該選定區(qū)域序列總長(zhǎng)為327bp，以80種檢索細(xì)菌的通用序列為標(biāo)準(zhǔn)，選定的序列區(qū)間為（857，1194），與Greisen，K等［6］選取的（976，1359）有差異。本區(qū)間經(jīng)Ribosomal Database Project－Release 10數(shù)據(jù)庫(kù)查詢合理，在今后的研究中，還需進(jìn)一步檢測(cè)更多標(biāo)準(zhǔn)菌株及臨床分離株，目前尚不足以評(píng)價(jià)該區(qū)間是否優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道。

圖8 地高辛標(biāo)記PCR產(chǎn)物雜交檢測(cè)芯片酶聯(lián)顯色結(jié)果

表1 12份痰標(biāo)本細(xì)菌培養(yǎng)與芯片檢測(cè)結(jié)果對(duì)比情況

本文針對(duì)自行設(shè)計(jì)的引物探針，以標(biāo)準(zhǔn)菌株及少量臨床標(biāo)本對(duì)細(xì)菌DNA模板抽提方法選擇，PCR條件的探索，芯片雜交條件的優(yōu)化等方面，不斷嘗試，取得了初步結(jié)果。

細(xì)菌DNA的提取方法對(duì)PCR實(shí)驗(yàn)的成功與否，至關(guān)重要。常用的化學(xué)法，煮沸法等提取方法，對(duì)革蘭陰性菌有良好的效果。因金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁的特殊脂質(zhì)成分，即使加入溶葡萄球菌素等試劑成分，DNA提取效果仍不理想，據(jù)D.Nicholas Adams［7］的方法，直接以一定濃度的金黃色葡萄球菌菌液做PCR的DNA模板，卻能取得較好效果，其原因有待進(jìn)一步研究。

在芯片雜交條件的摸索上，各特異性探針本身只有20－30bp，分子太小，很難直接點(diǎn)樣固定于硝酸纖維素膜上（孔徑200μm），可采用探針加尾，以增加分子大小。

雜交實(shí)驗(yàn)的成敗與酶聯(lián)顯色系統(tǒng)的性能也有很大關(guān)系，為保證顯色系統(tǒng)有效性，可在芯片適當(dāng)位置點(diǎn)樣酶標(biāo)抗體做陽(yáng)性對(duì)照。

在芯片雜交檢測(cè)臨床樣本時(shí)，2例使用抗生素后細(xì)菌培養(yǎng)陰性的標(biāo)本與嗜肺軍團(tuán)菌抗體IgM陽(yáng)性標(biāo)本均呈有色反應(yīng)，這與使用抗生素后常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性率太低及嗜肺軍團(tuán)菌為苛養(yǎng)菌難以常規(guī)培養(yǎng)有關(guān)。科學(xué)觀察芯片雜交檢測(cè)的特異性與敏感性，需要更多的臨床實(shí)驗(yàn)與數(shù)據(jù)。

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Construction of gene chip and its application in bacterium pneumonia

DONG Jin－lang1，LI Hua2，WANG Jian2，et al.
（1.Laiyang Central Hospital of Yantai，Laiyang265000，China；2.The Second Affiliated Hospital of Nanchang U－niversity，Nanchang330006，China）

Objective According to the characteristics of bacterial 16SrRNA gene，design specific probe to common pathogenic bacteria.Use of chromogenic enzyme gene chip technology and explore its clinical application.Methods Select Streptococcus pneumoniae，Haemophilus influenzae，and Pseudomonas aeruginosa eight kinds of bacterial pneumonia common standard strains of pathogens as the research object，and select the 12patients with sputum specimens for testing.Universal primers designed to conserved regions of the 16SrRNA gene PCR reactions and Gram－positive bacteria，Gram－negative bacteria universal probe，using the variable region of design differences SYNTHESIS specific probe，constructed gene chip.The use of bacterial 16SrRNA gene PCR universal primers designed to amplify all eight species of bacteria were obtained amplification product of 350bp.Digoxin labeled with specific probes can be used to complete construction of eight common pathogen detection microarray.Results 8standard strains of gene chips have achieved the desired effect.We detected 12sample of sputum，and 7cases culture－positive which corresponds to the chip test results were positive.In 5samples with negative culture results，there remained 3positive in gene chips，1identified as Legionella pneumophila and 2cases with antibiotics treatments earlier.Conclusion Currency primer of 16SrRNA has attributes of high specificity and sensitivity.Gene chip we constructed can be applicated to detect common clinic pathogen of bacterical pneumonia and clinic specimens，even those antibiotic use after clinical specimens and fastidious bacteria have certain diagnostic value.In this study，the gene chip for the detection of bacterial pneumonia is simple，fast，high specificity and sensitivity.

16SrRNA；Gene Chip；Bacterial Pneumonia

Q78

A

2013－10－20）

1007－4287（2014）07－1048－05

江西省衛(wèi)生廳基金資助項(xiàng)目（20061079）

＊通訊作者