溫見翔，陳 娟，楊 虹

（北京大學(xué)深圳醫(yī)院 檢驗(yàn)科，廣東 深圳518036）

陰溝腸桿菌是臨床常見的條件致病菌之一，亦是醫(yī)院獲得性感染的重要病原菌［1］。近年來，隨著廣譜抗菌藥物的廣泛使用，陰溝腸桿菌在抗生素的選擇性壓力下出現(xiàn)高耐藥性和多重耐藥。陰溝腸桿菌感染已成為醫(yī)院感染的重要致病菌之一。我院陰溝腸桿菌感染分布與耐藥狀況亦不容樂觀［2］，本研究通過檢測我院臨床分離的141株陰溝腸桿菌AcrAB－TolC外排系統(tǒng)acrA，acrB，tolC和acrR 4種基因，分析4種基因的攜帶分布，研究AcrAB－TolC外排系統(tǒng)基因與陰溝腸桿菌耐藥性之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1菌株鑒定與藥敏試驗(yàn)2010年5月至2013年6月從北京大學(xué)深圳醫(yī)院門急診及住院部患者痰液、尿液、血液、膿液、膽汁等標(biāo)本分離到的陰溝腸桿菌共計(jì)141株。所有菌株經(jīng) MicroScanWalkaway40細(xì)菌分析儀進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)，測其對各種抗生素的最小抑菌濃度（MIC）。同一患者同一部位分離出的陰溝腸桿菌，如藥敏結(jié)果相同，僅采用首次分離菌株。以大腸桿菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC27853為質(zhì)控菌株，藥敏結(jié)果依據(jù)CLSI2013年執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)判定。

1.2儀器與試劑美國德靈公司生產(chǎn)的 MicroScanWalkaway40型全自動細(xì)菌分析系統(tǒng)及該公司提供的陰性菌復(fù)合板；PCR擴(kuò)增儀為美國Biosytems公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)為美國BIO－RAD公司產(chǎn)品質(zhì)；標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA、Taq DNA聚合酶、pMD18－T載體、DNA膠回收試劑盒為TAKARA公司產(chǎn)品。

1.3AcrAB－TolC外排系統(tǒng)基因的擴(kuò)增根據(jù)AcrAB－TolC外排系統(tǒng)acrA，acrB，acrR和tolC 4種基因序列，設(shè)計(jì)PCR引物，并由TAKARA公司合成引物，引物序列及產(chǎn)物長度見表1。采用煮沸法提取各株陰溝腸桿菌基因組的DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。四種基因的PCR反應(yīng)總體積均為50μl（DNA聚合酶系統(tǒng)Premix Taq9.5μl，上游引物及下游引物各1μl，DNA模板2μl，去離子水36.5μl）?；驍U(kuò)增反應(yīng)條件分別為：acrA基因94℃預(yù)變性4min，95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)，72℃終末延伸5min；acrB基因94℃預(yù)變性4min，95℃變性30s，48℃退火30s，72℃延伸3min，共40個(gè)循環(huán)，72℃終末延伸5min；acrR基因94℃預(yù)變性4min，95℃變性30s，48℃退火30 s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)，72℃終末延伸5 min；tolC基因94℃預(yù)變性4min，95℃變性30s，43℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)，72℃終末延伸5min。PCR產(chǎn)物在含0.5mg／L溴化乙啶的1%瓊脂糖凝膠中電泳30min，使用BIO－RAD凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，分析PCR產(chǎn)物。

1.4擴(kuò)增產(chǎn)物的純化、克隆與測序PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收試劑盒回收并純化，將其與pMD－18T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌E coli JM109中，用含氨芐西林的LB平板篩選含陽性質(zhì)粒的菌落，陽性菌經(jīng)擴(kuò)增培養(yǎng)后送TAKARA公司進(jìn)行測序。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對結(jié)果進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。

表1 靶基因引物識別序列及目的產(chǎn)物長度

2 結(jié)果

2.1藥敏試驗(yàn)結(jié)果141株陰溝腸桿菌對常見抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表2。根據(jù)耐藥表型不同，將141株陰溝腸桿菌分為4組見表3。

表2 141株陰溝腸桿菌對常見抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

表3 141株陰溝腸桿菌耐藥表型分組

2.2AcrAB－TolC外排系統(tǒng)基因擴(kuò)增及測序結(jié)果acrA，acrB，acrR和tolC 4種基因在141株陰溝腸桿菌中均擴(kuò)增出陽性株，其PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果見圖1、圖2、圖3和圖4。4種基因PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆后測序，測序 結(jié) 果 與 （CNBI）Genbank 數(shù) 據(jù) 庫 （http：／／www.cnbi.nim.nih.gov BLAST 程序）進(jìn)行對比，同源性比對后證實(shí)，4種基因與陰溝腸桿菌同源性均為96%。

圖1 acrA基因PCR擴(kuò)增電泳圖

圖2 acrB基因PCR擴(kuò)增電泳圖

圖3 acrR基因PCR擴(kuò)增電泳圖

圖4 tolC基因PCR擴(kuò)增電泳圖

2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果141株陰溝腸桿菌分別擴(kuò)增出139株acrA基因陽性株，陽性率為98.58%；72株acrB基因陽性株，陽性率為51.06%；111株acrR基因陽性株，陽性率為78.72%；116株tolC基因陽性株，陽性率為82.27%，4種基因的陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表4。分別比較多重耐藥組、雙重耐藥組、單重耐藥組和敏感組不同基因的陽性率，acrA基因和acrB基因在4組菌株的陽性率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而AcrR基因和tolC基因的陽性率組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表5。

表4 4種基因陽性率的比較

表5 四種基因在不同組中陽性率的比較

3 討論

主動外排系統(tǒng)是引起細(xì)菌多重耐藥的機(jī)制之一，作為一種非特異性耐藥機(jī)制，可引起細(xì)菌固有的耐藥性［3，4］，而耐藥結(jié)節(jié)細(xì)胞分化家族 AcrAB－TolC外排系統(tǒng)是導(dǎo)致革蘭陰性菌多重耐藥性的重要因素［5－7］。陰溝腸桿菌染色體上存在acrA，acrB，acrR和tolC基因，可以編碼AcrAB－TolC外排泵，多重耐藥的陰溝腸桿菌存在活躍的AcrAB－To1C外排泵［8］，陰溝腸桿菌多重耐藥與主動外排系統(tǒng)有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，141株陰溝腸桿菌高水平攜帶AcrAB－TolC系統(tǒng)的acrA，acrB，acrR和tolC四種基因，其中acrA基因的陽性檢出率最高，acrB基因的陽性檢出率最低，四種基因的陽性檢出率有顯著的差異（P＜0.01）。根據(jù)耐藥表型的不同，將141株陰溝腸桿菌分為多重耐藥組、雙重耐藥組、單重耐藥組和敏感組，比較各組陰溝腸桿菌不同基因的陽性檢出率，acrA基因和acrB基因在不同組的陽性率有顯著性差異（P＜0.01），各耐藥組高于敏感組，且多重耐藥組陽性率最高；acrR基因和tolC基因在不同組的陽性率無顯著性差異。

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［8］劉 軍.陰溝腸桿菌耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.國外醫(yī)藥抗生素分冊，2009，30（2）：49.