劉金華，劉 韜，孟日增，聶丹丹，王瑋琳，王浩天

（1.吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局，吉林 長(zhǎng)春130062；2.吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130021）

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogens，LM）是一種重要的食源性致病菌，他能引起人類(lèi)和動(dòng)物李斯特氏菌病。人和動(dòng)物感染LM可引起單核細(xì)胞增多癥、腦膜炎、敗血癥和流產(chǎn)，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展［1，2］。該菌可通過(guò)眼睛及破損皮膚、粘膜進(jìn)入體內(nèi)而造成感染，該菌在4℃的環(huán)境中仍可生長(zhǎng)繁殖，也是冷藏食品中威脅人類(lèi)健康的主要病原菌之一，因此，在衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)中是一種重要的檢測(cè)目標(biāo)［3］。目前LM常用的檢測(cè)方法一般以生化培養(yǎng)鑒定、血清學(xué)檢測(cè)等為主［4］。光纖生物傳感器是激光技術(shù)和現(xiàn)代低消耗的光纖技術(shù)共同發(fā)展的產(chǎn)物，是目前應(yīng)用較為廣泛的生物傳感器之一［5，6］。本研究基于光纖倏逝波生物傳感器技術(shù)建立一種快速、高效檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的方法，該方法為L(zhǎng)M的衛(wèi)生檢驗(yàn)提供一種新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens，ATCC13124）、綿羊李斯特氏菌（listeria ivanovii，ATCC19119）、英諾克李斯特氏菌（listeria innocua，ATCC19119）、金 黃 色 葡 萄 球 菌 （Staphylococcus aureus，ATCC25923）、腸炎沙門(mén)氏菌（salmonella enteritidis，ATCC13076）、鼠傷寒沙門(mén)氏菌（Salmonella typhimurium，ATCC13311）、大 腸 埃 希 菌（Escherichia coli，ATCC25922）、蠟 樣 芽 胞 桿 菌（Bacillus cereus，ATCC11778））、單核細(xì)胞增生李斯 特 氏 菌 （Listeria monocytogens，LM，ATCC19111）、空腸彎曲桿菌（Campylobacter jejuni，ATCC33291）等均為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

1.2 主要儀器與試劑

光纖生物傳感器，聚苯乙烯光纖均由中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春光學(xué)精密機(jī)械研究所提供。LM多克隆抗體、LM單克隆抗體、納米量子點(diǎn)CdFe標(biāo)記的抗LM的多克隆抗體均由本實(shí)驗(yàn)室制備，磷酸鹽緩沖液PBS購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，牛津瓊脂OXA、胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯（TSB－YE）等LM培養(yǎng)基均購(gòu)自北京蘭伯瑞技術(shù)有限責(zé)任公司，1－乙基－3－（3－二甲氨基丙基）碳二亞胺鹽 （EDC）購(gòu)于北京晶美有限公司。

1.3 CdTe量子點(diǎn)與LM多克隆抗體的偶聯(lián)

取1ml的水溶性CdTe量子點(diǎn)與1ml PBS（pH＝7.4）緩沖液混合，將400μl的LM多克隆抗體（1mg／ml）加入到上述混合液中，然后將100μl新制備的EDC溶液（4mg／ml）加入到混合液中，樣品在37℃培養(yǎng)箱中避光反應(yīng)2個(gè)小時(shí)，然后4℃過(guò)夜。將2.5ml反應(yīng)混合液（包含1.0ml量子點(diǎn)，1.0ml PBS，400μl抗體，100μl EDC）5 000r／min離心2min，取上清液，上清用截留分子量為100000的超濾膜反復(fù)進(jìn)行超濾，去除小分子物質(zhì)和未反應(yīng)的CdTe量子點(diǎn)，收集超濾膜截留的CdTe－抗體偶聯(lián)物，然后用PBS（pH7.4）溶解，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 光纖的包被

按Sai V V等人方法［7］，對(duì)光纖進(jìn)行LM抗體包被，將光纖表面先用清洗液（濃HCl：乙醇體積比為1∶1）清洗10min，再用濃硫酸清洗10min，接下來(lái)在超純水中煮沸10min，使光纖表面具有親水的極化層。然后將處理好的光纖放入15μg／ml LM單抗的溶液中浸泡2h，取出用去離子水洗凈，即制成用于檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌光纖探針。

1.5 檢測(cè)靈敏度的確定

將LM菌株在TSB－YE液體培養(yǎng)基中42℃培養(yǎng)18h－24h。瓊脂平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。將包被LM的單克隆抗體的光纖分別插入濃度為3×100CFU／ml、3×101CFU／ml、3×102CFU／ml、3×103CFU／ml、3×104CFU／ml、3×105CFU／ml和3×106CFU／ml的LM菌溶液中孵育10min，加陰性對(duì)照，PBS清洗3遍后再與100μg／ml標(biāo)記量子點(diǎn)的多抗反應(yīng)10min，用去離子水洗凈上機(jī)測(cè)量結(jié)果。

1.6 特異性試驗(yàn)

用建立的方法對(duì)上述產(chǎn)氣莢膜梭菌、綿羊李斯特氏菌、英諾克李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、腸炎沙門(mén)氏菌、傷寒沙門(mén)氏菌、大腸埃希菌、蠟樣芽胞桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、空腸彎曲桿菌進(jìn)行特異性交叉試驗(yàn)，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照。

1.7 人工添加樣品的檢測(cè)

取雞肉25g加入225ml的TSB－YE液體培養(yǎng)基中，分別加入單核細(xì)胞增生李斯特菌懸液，使其濃度分別達(dá)到5CFU／ml，10CFU／ml，20CFU／ml，30CFU／ml，40CFU／ml，50CFU／ml。均質(zhì)后取2 ml上清，煮沸滅菌，各取1ml用于檢測(cè)。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將純培養(yǎng)的菌液用PBS緩沖液稀釋成3×100－3×106CFU／ml的濃度梯度，當(dāng)LM菌體濃度為3×101－3×106CFU／ml時(shí)，可檢測(cè)到明顯的陽(yáng)性信號(hào)；當(dāng)菌液濃度小于3×101CFU／ml時(shí)結(jié)果為陰性。故該方法對(duì)LM檢測(cè)的靈敏度可達(dá)到3×101CFU／ml，見(jiàn)圖1。

圖1 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌靈敏度的檢驗(yàn)

2.2 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

用建立的光纖倐逝波生物傳感器分別對(duì)105CFU／ml不同菌株的菌液檢測(cè)，顯示該方法對(duì)于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌具有較好的特異性，可以得到較明顯信號(hào)。其他菌株的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌特異性的檢驗(yàn)

2.3 人工添加樣品的檢測(cè)

將標(biāo)準(zhǔn)LM稀釋到一定濃度加入雞肉中，檢測(cè)結(jié)果如表1所示，其檢測(cè)靈敏度可達(dá)到30CFU／ml，即在樣品中若含有30CFU／ml的在單核細(xì)胞增生李斯特氏菌即可被檢出，而對(duì)于20CFU／mL的濃度的樣品3次檢測(cè)中可能有1－2次結(jié)果為陽(yáng)性。

表1 人工感染樣品檢測(cè)結(jié)果

3 討論

光纖倏逝波生物傳感器是以光纖和光電轉(zhuǎn)換器件為主要轉(zhuǎn)換元件的一種光電轉(zhuǎn)換設(shè)備［8］，他主要是利用倏逝波場(chǎng)來(lái)激發(fā)光纖表面標(biāo)記在生物分子上的熒光染料，從而檢測(cè)通過(guò)特異性反應(yīng)附著于纖芯表面倏逝波場(chǎng)范圍內(nèi)的生物分子［9，10］。由于倏逝波是光在光纖中以全反射傳播時(shí)產(chǎn)生的部分穿透界面的光波，他只存在于界面附近薄層內(nèi)，只對(duì)來(lái)自光纖界面附近極薄的一層熒光分子進(jìn)行熒光激發(fā)和收集，而樣品中游離的熒光分子則幾乎不會(huì)被激發(fā)和收集，這樣便省去了傳統(tǒng)生化檢測(cè)方法中繁冗復(fù)雜的清洗步驟，簡(jiǎn)化了操作步驟，將檢測(cè)時(shí)間從常規(guī)分析的幾個(gè)小時(shí)縮短到十幾分鐘，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間提高了檢測(cè)效率［11，12］。

當(dāng)光纖倏逝波生物傳感器檢測(cè)目標(biāo)菌時(shí)，光纖表面固定的生物識(shí)別分子抗體與目標(biāo)菌發(fā)生特異性反應(yīng)，進(jìn)而與熒光染料標(biāo)記的檢測(cè)抗體結(jié)合，使熒光染料固定于光纖表面，倏逝波激發(fā)出熒光，其中部分熒光進(jìn)入光纖，通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)換器將光信號(hào)轉(zhuǎn)換為物理信號(hào)，之后經(jīng)過(guò)放大處理，獲得數(shù)據(jù)。通過(guò)檢測(cè)是否激發(fā)出熒光信號(hào)及熒光信號(hào)的強(qiáng)度大小來(lái)分析待測(cè)物的有無(wú)及含量。與其他生物檢測(cè)手段相比，光纖生物傳感器具有如下優(yōu)點(diǎn)：首先該方法不受光纖表面倏逝波場(chǎng)以外的生物分子的干擾具有較高的檢測(cè)靈敏度；其次該技術(shù)操作簡(jiǎn)單，測(cè)量用時(shí)較短可應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)［9］。在本研究試驗(yàn)中，用納米量子點(diǎn)做熒光標(biāo)記物，相對(duì)于傳統(tǒng)的有機(jī)熒光染料來(lái)說(shuō)，納米量子點(diǎn)具有更高的靈敏性和穩(wěn)定性。使用納米量子點(diǎn)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的熒光染料檢測(cè)病原微生物，能夠獲得了更強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，更長(zhǎng)的發(fā)光時(shí)間以及能夠?qū)晒庑盘?hào)更精確的檢出，從而使得大大的提高了檢測(cè)的靈敏度。本實(shí)驗(yàn)中，完成一次檢測(cè)過(guò)程只需30 min，而且該檢測(cè)方法具有較高的靈敏度和較好的特異性，使得該技術(shù)具有較好的應(yīng)用前景。

［1］段 霞.單核細(xì)胞增生李斯特氏菌膠體金免疫層析方法的建立［D］.南昌大學(xué)，2011.

［2］梁雄燕，顧玉芳，楊玉瑩，等.雞單核細(xì)胞增生性李斯特菌病診斷與病原鑒定［J］.中國(guó)家禽，2014，36（1）：59.

［3］趙 靜，孫海娟，馮敘橋，等.食品中食源性致病菌污染狀況及其監(jiān)測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展［J］.食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2013，4（5）：1353.

［4］羅雁非，賈芙蓉，丁 旭，等.膠體金標(biāo)記單克隆抗體測(cè)定單增李斯特菌試劑盒制備［J］。中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2009，17（12）：1231.

［5］畢衛(wèi)紅，郭 璇，王凌霄.免標(biāo)記光纖生物傳感器的研究進(jìn)展［J］.燕山大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，37（3）：189.

［6］李 博，鄭 磊，王 前，等.電化學(xué)DNA生物傳感器設(shè)計(jì)及在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用進(jìn)展［J］.分子診斷與治療雜志，2011，3（1）：46.

［7］Rabbany SY，Donner BL，Ligler FS.Optical immunosensors［J］.Crit Rev Biomed Eng，1994，22（6）：307.

［8］Anderson GP，Rowe－Taitt CA，Ligler FS.Raptor：A Portable，Automated Biosensor［C］.Proceedings of the First Joint Conference on Point Detection for Chemical and Biological Defense，Williamsburg，Virginia，23－27October，2000：138－144.

［9］Carolina Beres，F(xiàn)abio Vieira，Batistade Nazare，et al.Tapered plastic optic fiber－based biosensor－Tests and application［J］.Biosensors and Bioelectronics，2011，30（1）：328.

［10］單 聰，陳西平.光纖倏逝波生物傳感器在微生物檢測(cè)中的應(yīng)用［J］.衛(wèi)生研究，2010，39（2）：254.

［11］黃惠杰，翟俊輝，趙永凱，等.多探頭光纖倏逝波生物傳感器及其性能研究［J］.中國(guó)激光，2004，31（6）：718.

［12］徐鎖生，魏 華.光纖倏逝波生物傳感器及其研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)通訊，2008，19（1）：148.