徐建偉，劉麗秋＊，趙小麗

（1.青島市第八人民醫(yī)院腎內(nèi)科，青島266100；2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青島266021）

骨形態(tài)發(fā)生蛋白－7通過(guò)TGFβ／smad信號(hào)通路抑制高糖誘導(dǎo)下足細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化

徐建偉1，劉麗秋1＊，趙小麗2

（1.青島市第八人民醫(yī)院腎內(nèi)科，青島266100；2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青島266021）

目的 通過(guò)觀察骨形態(tài)發(fā)生蛋白－7（BMP－7）對(duì)高糖環(huán)境培養(yǎng)下足細(xì)胞p－smad2／3、nephrin、desmin表達(dá)的影響探討B(tài)MP－7抑制足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化機(jī)制。方法 以體外培養(yǎng)的小鼠永生化足細(xì)胞為研究對(duì)象，將其分為以下4組：正常糖組（NG組，含D－葡萄糖5.5mmol／L）、高糖刺激組（HG組，含D－葡萄糖30mmol／L）、高糖＋BMP－7干預(yù)組（BMP－7組，含D－葡萄糖30mmol／L＋400ng／ml rhBMP－7）、甘露醇對(duì)照組（MN組，含D－葡萄糖5.5mmol／L＋甘露醇24.5mmol／L），各組干預(yù)時(shí)間為48h，應(yīng)用熒光定量PCR法檢測(cè)足細(xì)胞nephrin、desmin mRNA表達(dá)量，Western blot檢測(cè)足細(xì)胞p－smad2／3、nephrin、desmin蛋白表達(dá)量。結(jié)果 正常狀態(tài)下足細(xì)胞高表達(dá)nephrin，少量表達(dá)psmad2／3、desmin；高糖刺激可以上調(diào)足細(xì)胞p－smad2／3、desmin的表達(dá)、下調(diào)nephrin的表達(dá)（P＜0.05）；BMP－7與高糖共同培養(yǎng)在一定程度上可以抑制高糖引起的足細(xì)胞p－smad2／3表達(dá)上調(diào)，減少desmin表達(dá)，恢復(fù)nephrin表達(dá)（P＜0.05）；NG組與MN組之間比較p－smad2／3、nephrin、desmin表達(dá)水平無(wú)顯著差異（P＞0.05）。結(jié)論 BMP－7可能通過(guò)調(diào)節(jié)TGFβ／smad信號(hào)通路抑制高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。

足細(xì)胞；上皮細(xì)胞－間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化；骨形態(tài)發(fā)生蛋白－7；TGFβ／smad信號(hào)通路；糖尿病腎病

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1069）

研究已證實(shí)高糖能介導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生上皮－間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化（EMT），促進(jìn)腎臟纖維化發(fā)展。在多種細(xì)胞EMT過(guò)程中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF－β）被認(rèn)為是最重要的誘導(dǎo)因子［1］，研究發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境可以誘導(dǎo)腎臟內(nèi)TGF－β活性增強(qiáng)。骨形態(tài)發(fā)生蛋白－7（BMP－7）是TGF－β的拮抗劑，具有強(qiáng)大的抗纖維化作用，研究發(fā)現(xiàn)BMP－7可以阻斷TGF－β對(duì)腎小管上皮細(xì)胞EMT的促進(jìn)作用，延緩糖尿病腎?。―KD）的發(fā)展［2］。本研究通過(guò)觀察BMP－7對(duì)高糖環(huán)境培養(yǎng)下足細(xì)胞p－smad2／3、nephrin、desmin表達(dá)的影響探討B(tài)MP－7抑制足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 RPMI－1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清（美國(guó)hyclone公司），重組小鼠γ－干擾素、重組人BMP－7（美國(guó)Peprotech公司），Trizol試劑（美國(guó)invitrogen公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，Premix ExTaq（日本Takara公司），兔抗p－smad2／3抗體（美國(guó)cell signaling technology公司），兔抗nephrin抗體、兔抗desmin抗體、兔抗GAPDH抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG（中國(guó)博奧森公司）。

1.2 足細(xì)胞的培養(yǎng)與分組 小鼠永生性足細(xì)胞系由美國(guó)愛因斯坦大學(xué)Peter Mundel教授惠贈(zèng)。足細(xì)胞復(fù)蘇后于含10%胎牛血清，10U／mlγ－干擾素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在33℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。后轉(zhuǎn)入不含γ－干擾素的10%胎牛血清1640培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)10－14天，待細(xì)胞分化成熟后使用。將分化成熟的細(xì)胞接種于25cm2的培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞長(zhǎng)至70－80%融合時(shí)，于無(wú)血清的培養(yǎng)液中饑餓24h使細(xì)胞同步化。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶⒆慵?xì)胞分為4個(gè)組：正常糖組（NG，含D－葡萄糖5.5mmol／L）、高糖刺激組（HG，含D－葡萄糖30mmol／L）、高糖＋BMP－7干預(yù)組（BMP－7，含D－葡萄糖30mmol／L＋400ng／ml rhBMP－7）、甘露醇對(duì)照組（MN，含D－葡萄糖5.5mmol／L＋甘露醇24.5mmol／L），各組干預(yù)時(shí)間為48h。

1.3 熒光定量PCR 按照Trizol試劑說(shuō)明書提取各組細(xì)胞總RNA，然后利用260nm的吸光度測(cè)定OD值和RNA的濃度，按照RT－PCR試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件：37℃15 min，85℃5s。按照SYBR Premix Ex Taq說(shuō)明書在Light Cycler Real Time PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行SYBR Green I實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95℃30s預(yù)變性，然后95℃5s，60℃30s重復(fù)40個(gè)循環(huán)（引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度見表1）。每個(gè)樣品設(shè)2個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)無(wú)模板陰性對(duì)照。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，確定產(chǎn)物特異性。以GAPDH為內(nèi)參基因，以正常糖組為對(duì)照組，采用2－△△CT法對(duì)nephrin、desmin mRNA表達(dá)量進(jìn)行相對(duì)定量，△△Ct＝（Ct目的基因－－Ct管家基因）實(shí)驗(yàn)組－（Ct目的基因－Ct管家基因）對(duì)照組。

表1 目的基因引物序列及其擴(kuò)增產(chǎn)物大小

1.4 Western blot 收集各組細(xì)胞，提取蛋白于95℃變性5min。取上清，各組蛋白和marker分別上樣，10%SDS－聚內(nèi)烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂奶粉封閉后以兔抗psmad2／3、nephrin、desmin、GAPDH多克隆抗體分別4℃孵育過(guò)夜（分別按1∶500、1∶200、1：200、1：1000稀釋）。洗膜后用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶8 000）室溫孵育1h，ECL顯影，凝膠成像系統(tǒng)分析，Quantity One 4.6.2掃描其光密度值，以psmad2／3、nephrin、desmin條帶與內(nèi)參GAPDH條帶的光密度值之比值代表其蛋白的相對(duì)含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMP－7干預(yù)對(duì)高糖刺激足細(xì)胞nephrin、desmin mRNA表達(dá)的影響

實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，與NG組相比，HG組足細(xì)胞desmin表達(dá)明顯上調(diào)，為NG組的4.03倍，而nephrin表達(dá)則明顯下調(diào)，為NG組的0.37倍（P＜0.05）；BMP－7與高糖共培養(yǎng)可以減少高糖引起的足細(xì)胞nephrin、desmin的異常表達(dá)，（P＜0.05）；MN組與NG組相比較足細(xì)胞nephrin、desmin mRNA表達(dá)水平無(wú)顯著差異（P＞0.05）（表2，圖1）。

表2 各處理組足細(xì)胞nephrin、desmin mRNA的相對(duì)表達(dá)（ˉx±s，n＝3）

2.2 BMP－7干預(yù)對(duì)高糖刺激足細(xì)胞p－smad2／3、nephrin、desmin蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，NG組足細(xì)胞低表達(dá)p－smad2／3、desmin，高表達(dá)nephrin；與NG組相比，HG組足細(xì)胞p－smad2／3、desmin蛋白表量達(dá)明顯增加，nephrin蛋白表達(dá)量則明顯減少（P＜0.05）；與HG組相比，BMP－7組足細(xì)胞nephrin蛋白表達(dá)量增加，p－smad2／3、desmin蛋白表達(dá)量減少（P＜0.05），但與NG組相比仍有差異（P＜0.05）；NG組與MN組相比，足細(xì)胞p－smad2／3、nephrin、desmin蛋白表達(dá)量無(wú)顯著差異（P＞0.05）（圖2－4）。

圖1 各處理組足細(xì)胞nephrin、desmin mRNA的相對(duì)表達(dá)（實(shí)時(shí)定量PCR）

圖2 各處理組足細(xì)胞p－smad2／3蛋白的相對(duì)表達(dá)（Western blot）

圖3 各處理組足細(xì)胞nephrin蛋白的相對(duì)表達(dá)（Western blot）

圖4 各處理組足細(xì)胞desmin蛋白的相對(duì)表達(dá)（Western blot）

3 討論

近年來(lái)有實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，DKD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可伴隨足細(xì)胞表型的改變。柏鳳等［3］通過(guò)高糖刺激體外培養(yǎng)的足細(xì)胞，證實(shí)高糖能夠誘導(dǎo)足細(xì)胞α－SMA和FN表達(dá)，并降低CD2AP和WT－l表達(dá)，提示高糖可能通過(guò)誘導(dǎo)足細(xì)胞發(fā)生EMT。Yamaguchi等［4］發(fā)現(xiàn)在DKD患者尿中丟失的足細(xì)胞非凋亡狀態(tài)，且足細(xì)胞表達(dá)成纖維細(xì)胞特異蛋白－1（FSP－1），表明足細(xì)胞發(fā)生EMT，從而自GBM脫落。本研究通過(guò)體外高糖環(huán)境下培養(yǎng)足細(xì)胞，觀察到高糖刺激下調(diào)足細(xì)胞nephrin表達(dá)，上調(diào)desmin表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了高糖可以誘導(dǎo)足細(xì)胞發(fā)生EMT。

腎臟EMT機(jī)制的研究目前多集中于腎小管上皮細(xì)胞，其中，TGFβ／smad信號(hào)通路是介導(dǎo)腎臟纖維化最重要的信號(hào)轉(zhuǎn)到途徑［5］。DKD時(shí)，腎臟TGFβ1表達(dá)增加并激活其下游smad2、smad3，后者磷酸化后結(jié)合samd4并轉(zhuǎn)入核內(nèi)，介導(dǎo)腎小管上皮轉(zhuǎn)分化及腎臟纖維化發(fā)展［6］。BMP－7又稱骨調(diào)素－1（OP－1），屬于骨形態(tài)發(fā)生蛋白亞家族（BMPs）。BMP－7最早被認(rèn)為是誘導(dǎo)骨生成，隨后基因敲除實(shí)驗(yàn)證實(shí)了其在腎臟發(fā)育中的重要作用［7］。近年發(fā)現(xiàn)BMP－7是體內(nèi)一種強(qiáng)有力的抗纖維化因子，多項(xiàng)研究明確證實(shí)對(duì)慢性腎損傷的不同動(dòng)物模型給予重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白－7（rhBMP－7）能夠減少腎纖維化，改善腎功能［8］。研究發(fā)現(xiàn)BMP－7在系膜細(xì)胞和小管上皮細(xì)胞中可以通過(guò)拮抗TGFβ信號(hào)改善腎臟纖維化［9，10］。后來(lái)，Wang等［11］通過(guò)基因轉(zhuǎn)染的技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，BMP－7可抑制DKD大鼠足細(xì)胞數(shù)量的減少及足細(xì)胞的nephrin蛋白表達(dá)水平的降低，減少腎間質(zhì)膠原Ⅰ的沉積、纖維連接蛋白（FN）的表達(dá)，同時(shí)減輕尿蛋白和腎小球纖維化，提示BMP－7可逆轉(zhuǎn)足細(xì)胞EMT，在DKD中發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。本研究中BMP－7與高糖共培養(yǎng)足細(xì)胞48h可以有效減輕高糖誘導(dǎo)的nephrin表達(dá)下調(diào)和desmin過(guò)表達(dá)，提示BMP－7可以抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞EMT。本研究還發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境中足細(xì)胞psmad2／3信號(hào)活化，提示存在TGFβ／samd信號(hào)通路的激活，而BMP－7與高糖共培養(yǎng)可以抑制psmad2／3表達(dá)，在一定程度上拮抗高糖引起的TGFβ／samd信號(hào)通路的活化，這可能是BMP－7抑制高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞EMT的重要機(jī)制。需要注意的是，高糖環(huán)境下足細(xì)胞內(nèi)還存在著其他信號(hào)通路的活化，如Integrin／ILK通路、Wnt／β－catenin通路等，這些通路組成錯(cuò)綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，并在不同層面相互作用，共同調(diào)控EMT過(guò)程。

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Effect of BMP－7 on podocyte Epithelial－Mesenchymal Transition induced by high glucose via TGFβ／smad signal pathway

XU Jian－wei，LIU Li－qiu，ZHAO Xiao－li.
（The Eighth People’s Hospital of Qingdao，Qingdao 266100，China）

Objective To investigate the effect of BMP－7on p－smad2／3expression and epithelial－mesenchymal transition in mice podocyte induced by high glucose.Methods Cultured mice podocyte cells were randomly divided into four groups：normal glucose group（NG，D－glucose 5.5mmol／L），high glucose group（HG，D－glucose 30mmol／L），BMP－7 group（BMP－7，D－glucose 30mmol／L＋rhBMP－7 400ng／ml），mannitol control group（MN，D－glucose 5.5mmol／L＋mannitol 24.5mmol／L）.Cells of different groups were harvested after treatment of 48hours.The mRNA expressions of nephrin and desmin in podocyte were detected by RT－PCR and the protein expressions of p－smad2／3、nephrin and desmin were detected by Western blot.Results After treatment with high glucose for 48h，the expressions of psmad2／3and desmin were up－regulated while the expression of nephrin was decreased（P＜0.05）.BMP－7alleviated the changes of expressions of p－smad2／3、nephrin and desmin in podocyte induced by high glucose significantly（P＜0.05）.There was no significant differences between NG group and MN group（P＞0.05）.Conclusion BMP－7can inhibit EMT in podocyte induced by high glucose possibly via TGFβ／smad signal pathway.

podocyte；epithelial－mesenchymal transition；BMP－7；TGFβ／smad signal pathway；diabetic kidney disease

Q786

A

2013－07－26）

1007－4287（2014）07－1069－04

＊通訊作者