高克非，曾根

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科，廣東廣州 510405；2.海南省中醫(yī)院婦產(chǎn)科，海南?？?570203)

維生素C對三氧化二砷抑制上皮性卵巢癌增殖的增敏效應(yīng)研究

高克非1，曾根2

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科，廣東廣州 510405；2.海南省中醫(yī)院婦產(chǎn)科，海南海口 570203)

目的觀察維生素C對三氧化二砷(AS2O3)抑制上皮性卵巢癌細胞株的化療增敏效應(yīng)并探討其凋亡蛋白相關(guān)機制。方法以上皮性卵巢癌細胞株OVCAR-3為研究對象，以噻唑藍(MTT)藥敏試驗、流式細胞儀以及蛋白質(zhì)印跡法檢測維生素C對AS2O3化療的增敏效應(yīng)及其機制。結(jié)果AS2O3和Vitamin C單藥對上皮性卵巢癌細胞株均具有劑量依賴性的生長抑制作用，IC50值分別為4.72 μmol/L和21.85 μmol/L。AS2O3聯(lián)合Vitamin C的實驗中，OVCAR-3細胞株的增殖抑制率均大于同濃度AS2O3單藥的抑制率，P值分別為0.001和0. 012；兩組聯(lián)合用藥的q值分別為2.71和1.63，均大于1.15，提示兩藥聯(lián)合具有協(xié)同抑制效應(yīng)。流式細胞檢測顯示，AS2O3聯(lián)合Vitamin C后S期阻滯效應(yīng)明顯，凋亡率增加。蛋白質(zhì)印記法結(jié)果顯示，兩藥聯(lián)合作用后，Bcl-2表達明顯下調(diào)，Bax表達明顯上調(diào)。結(jié)論在上皮性卵巢癌細胞株，一定濃度范圍的Vitamin C對AS2O3具有較好的化療增敏效應(yīng)，AS2O3和Vitamin C的聯(lián)合應(yīng)用具有進一步研究的價值。

維生素C；三氧化二砷；化療；卵巢癌

卵巢癌是死亡率最高的一類婦科惡性腫瘤，卵巢癌的化療及化療研究在卵巢癌治療和科研中占有非常重要的地位。三氧化二砷(AS2O3)是從血液病向?qū)嶓w瘤擴展應(yīng)用研究的一類凋亡誘導(dǎo)藥物，目前在血液病和包含卵巢癌在內(nèi)的多種實體瘤均有研究報道[1-4]，同時有研究證明維生素C對AS2O3具有良好的化療增敏效應(yīng)，該效應(yīng)可以使AS2O3的應(yīng)用劑量降低從而減輕其毒副作用，同時提高其藥效，而該效應(yīng)在卵巢癌鮮有報道。因此，本研究擬在上皮性卵巢癌細胞株中觀察維生素C對AS2O3的化療增敏效應(yīng)，嘗試在體外探討這兩種藥物相結(jié)合作為卵巢癌化療方法的可行性。

1 材料與方法

1.1 細胞系及主要試劑人上皮性卵巢癌細胞株OVCAR-3細胞株由中山大學(xué)腫瘤防治中心實驗研究部符立梧教授、梁永矩老師惠贈。RPMI-1640培養(yǎng)液為美國GIBCO公司產(chǎn)品，優(yōu)級胎牛血清(FBS)為杭州四季青公司產(chǎn)品。亞砷酸注射液為伊達藥業(yè)有限公司惠贈。維生素C注射液為南京金陵藥液有限公司產(chǎn)品。胰蛋白酶、噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)均為美國Sigma公司產(chǎn)品。酶標(biāo)儀型號BIO-TEK ELX800，流式細胞儀型號Beckman-Coulterc ELITE。Bcl-2、Bax抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗均購自美國SantaCruz公司。

1.2 細胞培養(yǎng)上皮性卵巢癌細胞株OVCAR-3于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，在37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞呈貼壁生長。

1.3 MTT實驗取處于對數(shù)生長期的OVCAR-3，以2.5×103/孔接種于96孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h，更換含不同濃度的Vitamin C和AS2O3的培養(yǎng)液。實驗分為Vitamin C單藥、AS2O3單藥、AS2O3聯(lián)合Vitamin C劑量依賴和同一聯(lián)合濃度時間依賴等4個部分。兩種藥物的單藥實驗均等比設(shè)置了5個藥物濃度梯度，聯(lián)合藥物實驗首先設(shè)置了1.24 μmol/L和2.48 μmol/L的AS2O3均聯(lián)合1.39 μmol/L的Vitamin C進行檢測，再將固定濃度2.48 μmol/L的AS2O3聯(lián)合1.39 μmol/L的Vitamin C分別在24 h、48 h和72 h進行時間依賴性細胞抑制觀察。細胞培養(yǎng)68 h后加入MTT溶液(10 mg/ml)10 μl，再放入培養(yǎng)箱反應(yīng)4 h，加入DMSO振蕩，上酶標(biāo)儀測定OD值(A 570 nm)。實驗重復(fù)3次，取3次實驗結(jié)果的平均值作為實驗結(jié)果。腫瘤細胞增殖抑制率＝[1-(物處理組A值-空白對照組A值)/(細胞對照組A值-空白對照組A值)]× 100%。按金氏公式[q=Ea+b/Ea+Eb-Ea×Eb]計算所得q值評價兩種藥物聯(lián)合作用效果，式中Ea+b為聯(lián)合用藥的有效率，Ea和Eb分別為兩種藥物單藥的有效率，q值在0.85～1.15范圍為兩藥合用呈單純相加效應(yīng)，q值大于1.15為兩藥合用具有協(xié)同效應(yīng)，q值小于0.85為兩藥合用具有拮抗效應(yīng)。

1.4 流式細胞儀檢測OVCAR-3細胞培養(yǎng)24 h后以不同濃度的AS2O3、Vitamin C單藥培養(yǎng)液或不同濃度的Vitamin C聯(lián)合AS2O3培養(yǎng)液處理細胞48 h(各處理組的藥物濃度詳見圖1)。收集全部細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，冰預(yù)冷70%乙醇固定，1 500 r/min，離心半徑15 cm，離心5 min，1%RNAase和PI染液處理，行流式細胞儀檢測凋亡比率及細胞周期。CELLQuest軟件采集樣本，ModFit LT軟件分析結(jié)果。觀察濃度依賴性的凋亡情況和細胞周期的變化。實驗重復(fù)3次，實驗結(jié)果以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達OVCAR-3細胞經(jīng)2.48 μmol/L的AS2O3單藥和分別聯(lián)合1.39 μmol/L、2.77 μmol/L Vitamin C作用12 h后，按常規(guī)方法提取總蛋白，經(jīng)蛋白定量后以SDS-PAGE電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，室溫下用3%小牛血清封閉1 h，隨后加入1.5%BSA稀釋的一抗，輕搖過夜，TBST緩沖液洗4次，于1.5% BSA稀釋的二抗中孵育1 h，TBST洗4次，ECL化學(xué)發(fā)光試劑反應(yīng)2 min，照相、分析、保存。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，IC50值的計算采用概率單位法。樣本間均數(shù)的比較采用配對資料t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AS2O3和Vitamin C單藥及聯(lián)合對OVCAR-3細胞株的生長抑制作用MTT實驗中，AS2O3和Vitamin C對OVCAR-3細胞株均呈現(xiàn)藥物濃度依賴性的生長抑制作用，其抑制細胞增殖的IC50值分別為4.72 μmol/L和21.85 μmol/L(圖1A、圖1B)。AS2O3聯(lián)合Vitamin C的實驗中，OVCAR-3細胞株的增殖抑制率均大于同濃度AS2O3單藥的抑制率。將聯(lián)合用藥的OD值與AS2O3單藥的OD值進行t檢驗，結(jié)果顯示，兩組的P值分別為0.001和0.012(圖1 C)。1.24 μmol/LAS2O3單藥的抑制率為7.9%，2.48 μmol/L AS2O3單藥的抑制率為24.6%，1.39 μmol/L的Vitamin C的單藥抑制率為3.0%，按金氏公式計算兩聯(lián)合用藥組的q值分別為2.71和1.63。取2.48 μmol/LAS2O3聯(lián)合1.39 μmol/L的Vitamin C分別于24 h、48 h和72 h觀察抑制率，三個時間點的聯(lián)合作用q值分別為1.49、1.52、1.63(圖1 D)。以上濃度依賴和時間依賴的聯(lián)合實驗P值均小于0.05，q值均大于1.15，提示一定濃度的Vitamin C對AS2O3具有明顯的化療增敏效應(yīng)，并且兩藥聯(lián)合具有協(xié)同效應(yīng)。

圖1 AS2O3和Vitamin C單藥及聯(lián)合對OVCAR-3細胞株均的生長抑制作用（藥物作用72 h）

2.2 AS2O3聯(lián)合Vitamin C對OVCAR-3細胞凋亡及細胞周期的影響流式細胞儀檢測AS2O3聯(lián)合不同濃度Vitamin C實驗結(jié)果顯示，2.48 μmol/LAS2O3單藥以及與1.39 μmol/L、2.77 μmol/L、5.54 μmol/L的Vitamin C聯(lián)合后，其誘導(dǎo)凋亡率逐步升高，各聯(lián)合用藥的凋亡率與AS2O3單藥組比較經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表1、圖2。細胞周期結(jié)果顯示，在聯(lián)合了Vitamin C之后，不僅細胞凋亡比率增加，其S期的比率增加也較顯著，而G2/M期的比例較AS2O3單藥組降低。各聯(lián)合用藥的S期比率與AS2O3單藥組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表1、圖2。

2.3 AS2O3單藥及聯(lián)合不同濃度Vitamin C作用后OVCAR-3細胞Bcl-2和Bax蛋白的表達見圖3，OVCAR-3細胞經(jīng)AS2O3單藥及與不同濃度的Vitamin C聯(lián)合作用，隨著Vitamin C濃度的增加，凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達逐漸降低，凋亡促進蛋白Bax的表達逐漸升高。

表1 AS2O3聯(lián)合Vitamin C對OVCAR-3細胞凋亡及細胞周期的影響(藥物作用48 h，±s)

表1 AS2O3聯(lián)合Vitamin C對OVCAR-3細胞凋亡及細胞周期的影響(藥物作用48 h，±s)

組別細胞周期比率(%)空白對照AS2O32.48 μmol/L AS2O32.48 μmol/L+Vit C 1.39 μmol/L AS2O32.48 μmol/L+Vit C 2.77 μmol/L AS2O32.48 μmol/L+Vit C 5.54 μmol/L凋亡率(%) 3.7±1.2 10.3±1.5 26.1±1.0a31.5±1.8a36.1±1.9aG1 S 68.8±2.2 28.4±1.1 37.3±1.0 32.8±1.2 28.0±0.6 24.7±2.5 25.7±0.5 32.9±0.9a43.8±1.8a47.0±1.5aG2/M 6.5±1.8 45.9±0.8 29.7±1.1 23.6±1.0 25.0±1.3

圖2 流式細胞儀檢測AS2O3聯(lián)合Vitamin C對OVCAR-3細胞株的誘導(dǎo)凋亡和細胞周期阻滯作用

圖3 AS2O3單藥及聯(lián)合不同濃度Vitamin C作用12 h后OVCAR-3細胞Bcl-2和Bax蛋白的表達

3 討論

AS2O3對以早幼粒細胞白血病(APL)為代表的血液系統(tǒng)惡性疾病的療效為全世界所公認(rèn)，并且該藥對實體瘤治療的有效性也得到了廣泛的研究和認(rèn)可。研究證實，AS2O3對非耐藥和耐藥的卵巢癌細胞株均有抑制作用[1，5]。具有雙向氧化還原性質(zhì)的維生素C，利用其作為前氧化劑的特點，可降低細胞內(nèi)GSH水平，已證明對AS2O3具有較好的化療增敏效應(yīng)，在肺癌、肝癌、結(jié)直腸癌等實體瘤方面已有報道[6-8]，但在卵巢癌方面鮮有相關(guān)報道。因此，本研究以卵巢癌細胞株OVCAR-3為研究對象，探討Vitamin C對AS2O3的增敏效應(yīng)及其凋亡蛋白相關(guān)的分子機制。

本研究顯示，AS2O3和Vitamin C單藥對OVCAR-3細胞均具有劑量依賴性的抗腫瘤效應(yīng)，二者的IC50值分別為4.72 μmol/L和21.85 μmol/L。AS2O3聯(lián)合Vitamin C的實驗中，OVCAR-3細胞株的增殖抑制率均大于同濃度AS2O3單藥的抑制率，且P＜0.05，由此可見，一定濃度的Vitamin C對AS2O3具有明顯的化療增敏效應(yīng)。流式細胞儀的檢測從細胞周期和細胞凋亡角度進一步證實了Vitamin C對AS2O3具有明顯的促進凋亡作用，并且聯(lián)合作用后的S期阻滯效應(yīng)明顯。應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法檢測Vitamin C對AS2O3的化療增敏效應(yīng)，可見凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達較AS2O3單藥作用明顯降低，而凋亡促進蛋白Bax表達進行性升高。

國內(nèi)蔣碧佳等[8]對肺腺癌進行細胞及裸鼠移植瘤的系列研究，結(jié)果顯示AS2O3和Vitamin C聯(lián)合用藥組在增殖抑制、誘導(dǎo)凋亡方面均高于單藥用藥組，其機制與Survivin和VEGF的表達下調(diào)有關(guān)。本研究的結(jié)果與以上肺癌的研究結(jié)論相一致，說明AS2O3和Vitamin C這兩種藥物在包括肺癌、卵巢癌在內(nèi)的實體瘤方面均具有切實的聯(lián)合用藥效果。Caspase和Bcl-2兩個蛋白家族都是凋亡通路中的重要蛋白，二者既相互聯(lián)系，作用機制又有區(qū)別。本研究在凋亡方面將Bcl-2和Bax這兩種Bcl-2家族蛋白作為研究對象，結(jié)果顯示出聯(lián)合用藥的Bcl-2表達下調(diào)和Bax的表達上調(diào)均高于單藥組，結(jié)合肺癌的研究結(jié)果，提示包括Caspase和Bcl-2等家族蛋白在內(nèi)的不同的凋亡通路和分子可能都參與了AS2O3和Vitamin C聯(lián)合用藥的促凋亡機制，而Galimberti等[9]的研究結(jié)果同樣證實了Bcl-2家族的參與。

有關(guān)Vitamin C對AS2O3增敏作用的基礎(chǔ)機制，現(xiàn)有研究顯示：AS2O3是直接作用于線粒體，增加線粒體內(nèi)活性氧簇(ROS)的生成，并使其氧化還原系統(tǒng)喪失，而細胞內(nèi)GSH水平是細胞對AS2O3誘導(dǎo)凋亡敏感性的關(guān)鍵[10-11]；在白血病細胞和肺成纖維細胞中Vitamin C提高AS2O3療效的主要機制是降低細胞內(nèi)GSH水平，從而提高AS2O3誘導(dǎo)的ROS水平，加劇線粒體的氧化損傷促進凋亡進程[11-12]，在卵巢癌細胞中維生素C的增敏機制是否與血液病相同呢？本課題組下一步將對OVCAR-3細胞中維生素C的氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)的分子機制進一步求證，并開展相關(guān)動物實驗，以期為臨床試驗打下堅實的基礎(chǔ)。

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[3]溫小明,程惠安,招衛(wèi)乾.應(yīng)用亞砷酸艾迪治療晚期肝癌臨床分析[J].海南醫(yī)學(xué),2010,21(15):15-17.

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Role of Vitamin C as a sensitizer for arsenic trioxide in epithelial ovarian cancer cells.

GAO Ke-fei1，ZENG Gen2. 1.Department of Gynecology,the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510405,Guangdong,CHINA;2.Department of Gynecology and Obstetrics,Hainan Provincial Traditional Chinese Medicine Hospital,Haikou 570203,Hainan,CHINA

ObjectiveTo investigate the role of Vitamin C as a sensitizer for arsenic trioxide in epithelial ovarian cancer cells and the apoptotic mechanisms.MethodsIn OVCAR-3 cells,the anti-cancer effects were observed when Vitamin C or AS2O3was given alone,and the sensitizing effects of Vitamin C were observed when it was used in the combination with arsenic trioxide.MTT chemosensitivity test,Flow Cytometry for examination of apoptosis and cell cycle status and Western-blot were applied.ResultsDose-dependent antiproliferative effect on epithelial ovarian cancer cell lines was observed when Vitamin C or AS2O3was applied as single agent,the IC50 value was 4.72 μmol/L and 21.85μmol/L respectively.When the two agents were applied simultaneously,the growth inhibition rate was significantly higher than that of the group treated with AS2O3alone,and the P value of the two combined regimen experiments were 0.001,0.012 respectively,the q value of the combined effects was 2.71,1.63 respectively. These results showed synergistic effect of the two agents.Flow Cytometry testing showed significant S phase block and increased apoptosis rate in the combination treatment group.In Western-blot experiments,Bcl-2 expression of the combination treatment group was down-regulated，and Bax expression was up-regulated compared with the group treated by AS2O3alone.ConclusionVitamin C has sensitizing effect on arsenic trioxide in the treatment of epithelial ovarian cancer cell lines,which should be promising in the further study.

Vitamin C;Arsenic trioxide;Chemotherapy;Ovarian carcinoma

R737.31

A

1003—6350（2014）16—2350—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.16.0919

2014-04-26)

高克非。E-mail：schsums@163.com