馮再平，沐萬(wàn)孟，江 波，* ，薛 冬

(1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122;2.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730050;3.太極集團(tuán)浙江東方制藥有限公司，浙江紹興312000)

D－阿洛糖是一種無(wú)毒、無(wú)卡路里，具有重要生理功能的稀有糖，是 D－阿洛酮糖的醛糖異構(gòu)體［1］。D－阿洛糖的生理功能包括:能夠抑制不同來(lái)源的癌細(xì)胞系［2－5］、抗氧化［6］、抗高血壓［7］、保護(hù)局部缺血傷害［8］、用作動(dòng)物細(xì)胞抗凍劑［9］、用于器官移植的免疫抑制［10］等。D－阿洛糖優(yōu)異的抑癌作用，以及在癌癥治療中與放療［11］、化療［12］等手段同時(shí)使用時(shí)顯著的協(xié)同輔助治療作用，使其成為近年來(lái)功能性稀有糖研究中的熱點(diǎn)。而一種新型的糖磷酸異構(gòu)酶——核糖－5－磷酸異構(gòu)酶 B(ribose－5－phosphate isomerase，RpiB，EC 5.3.1.6)［13］，可以可逆催化 D－阿洛酮糖和D－阿洛糖之間的酮醛糖異構(gòu)化反應(yīng)，是D－阿洛糖生物合成中的一類重要酶類。雖然該反應(yīng)中用作底物的D－阿洛酮糖也是一種稀有糖，但是可以通過(guò)D－塔格糖－3－差向異構(gòu)酶催化差向異構(gòu)化反應(yīng)，由較便宜的D－果糖獲得［14］。韓國(guó)建國(guó)大學(xué)的Park研究組最先報(bào)道了Clostridium thermocellum來(lái)源的RpiB在大腸桿菌中表達(dá)后，具有產(chǎn)D－阿洛糖的生物活性［15］;在此基礎(chǔ)上又研究了Clostridium thermocellum RpiB的 底 物 特 異 性［16］及 定 點(diǎn) 突 變［17］。 本 研 究 以Thermotoga lettingae TMO基因組為模板，構(gòu)建獲得重組質(zhì)粒pET22b－tl－rpib，并在大腸桿菌中成功實(shí)現(xiàn)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物重組RpiB及含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌基因工程菌，均具有產(chǎn)D－阿洛糖的生物活性，可作為工業(yè)化生產(chǎn)高附加值的稀有糖——D－阿洛糖的備選生物催化劑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)、引物、質(zhì)粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒 均購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司;Thermotoga lettingae TMO菌株BAA－301 購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American type culture collection，ATCC);PMD19－ T Simple Vector、DL10，000 DNA Marker、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(低)、限制性內(nèi)切酶Nde I和Xho I、Premix TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、Isopropyl β－D－1－thiogalactopyranoside(IPTG)等 購(gòu)于TaKaRa公司;Chelating Sepharose Fast Flow、Sephdex G25 購(gòu)自GE;D－阿洛酮糖、D－阿洛糖標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于Sigma公司;克隆載體pET－22b(+)中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王玉珍教授惠贈(zèng)。

AuthorizedThermalCyclerPCR儀 德國(guó)eppendorf;Agilent1200高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司;核酸蛋白電泳電源系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)美國(guó)Bio Rad;5904R冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Thermotoga lettingae TMO RpiB的基因擴(kuò)增依據(jù)Thermotoga lettingae TMO RpiB基因序列設(shè)計(jì)引物，在上下游引物5'端分別引入Nde I和Xho I的酶切位點(diǎn)。引物序列如下:

引物1:5'－GCCATATGAAGATAGCCATCGG TTGTGAC－3'

引物2:5'－CATGCTCGAGTTTATCCATCTCC TCAATCT－3'

以Thermotoga lettingae TMO菌液DNA為模板，PCR擴(kuò)增 RpiB基因。擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性5min;98℃ 變性 10s，58℃ 退火延伸 30s，72℃ 延伸1min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，4℃保藏。

1.2.2 PCR產(chǎn)物的亞克隆、鑒定 用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，然后將純化產(chǎn)物連接至PMD19－T Simple Vector，轉(zhuǎn)化宿主菌 E.coli DH5α，涂布于藍(lán)白斑篩選平板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。選取白色菌落接種至LB液體培養(yǎng)基(含50μg/mL氨芐抗生素)中，37℃、200r/min培養(yǎng)過(guò)夜，抽提質(zhì)粒并測(cè)序鑒定。將鑒定為陽(yáng)性克隆的重組質(zhì)粒命名為T(mén)－tl－rpib。

1.2.3 Thermotoga lettingae TMO RpiB基因工程菌的構(gòu)建 將T－tl－rpib及質(zhì)粒 pET－22b(+)分別用限制性內(nèi)切酶Nde I和Xho I處理，回收目的片段后，加T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。通過(guò)篩選與鑒定，獲得重組質(zhì)粒陽(yáng)性克隆，重組質(zhì)粒命名為pET22b－tl－rpib，重組工程菌命名為 E.coli BL21/pET22b－tl－rpib。

1.2.4 Thermotoga lettingae TMO RpiB的誘導(dǎo)表達(dá)挑取重組菌E.coli BL21/pET－22b－tl－rpib單菌落接種至裝有適量LB液體培養(yǎng)基(含50μg/mL氨芐抗生素)的試管中，37℃下200r/min培養(yǎng)過(guò)夜。再按2%接種量將其接種至大體積的LB培養(yǎng)基中，同條件下振蕩培養(yǎng)，當(dāng)菌體的OD600值為0.6～0.8時(shí)，加入一定濃度的IPTG，在較低溫度下誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)。選取誘導(dǎo)表達(dá)中比較重要的三個(gè)影響因素(誘導(dǎo)劑的濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度)，進(jìn)行表達(dá)條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。測(cè)定誘導(dǎo)劑濃度及誘導(dǎo)溫度對(duì)蛋白表達(dá)的影響時(shí)，誘導(dǎo)時(shí)間取4h，分別比較了20℃和28℃下，誘導(dǎo)劑 IPTG 濃度為0、0.5、1.0、2.0mmol/L 時(shí)，重組蛋白表達(dá)的情況;測(cè)定誘導(dǎo)時(shí)間的影響時(shí)，誘導(dǎo)溫度取28℃，IPTG濃度取0.5mmol/L。誘導(dǎo)后的菌液，加入SDS樣品緩沖液，混勻后煮沸幾分鐘，高速離心約1min，取20μL上清液進(jìn)行SDS－PAGE電泳分析(4%濃度的濃縮膠，15%濃度的分離膠)。

1.2.5 Thermotoga lettingae TMO RpiB的分離純化

低溫離心(8000×g，15min，4℃)收集菌體，然后以平衡緩沖液(200mmol/L NaCl，20mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.4)重懸菌體，超聲破碎大腸桿菌細(xì)胞10min(250W，開(kāi)1s/關(guān)2s)后，低溫離心(10000 ×g，30min，4℃)棄細(xì)胞碎片，收集上清液進(jìn)行以下層析純化。采用Ni2+－Chelating Sepharose Fast Flow親和層析柱(1.0cm×10.0cm)，對(duì)重組 Thermotoga lettingae TMO RpiB進(jìn)行純化。上柱前預(yù)先用平衡液平衡層析柱，蛋白酶液上柱后以洗滌液(平衡液+200mmol/L咪唑)洗脫雜蛋白，再用洗脫液(平衡液+500mmol/L咪唑)洗脫重組蛋白，SDS－PAGE進(jìn)行電泳分析。收集的重組蛋白洗脫液過(guò)Sephdex G25脫鹽柱脫鹽，超濾濃縮至適當(dāng)體積，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量。

1.2.6 產(chǎn)D－阿洛糖活性鑒定 分別以250mmol/L的D－阿洛酮糖為反應(yīng)底物，加入20mL發(fā)酵菌液相當(dāng)量的E.coli BL21/pET22b－tl－rpib的靜息細(xì)胞和分離純化得到的 Thermotoga lettingae TMO RpiB，在55℃，pH8.0的 100mmol/L Tris－HCl緩沖液中反應(yīng)3h。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物用Agilent 1200高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，色譜條件為:糖柱 Waters Sugarpak－1;Shodex示差折光檢測(cè)器;流動(dòng)相為純水;流速為0.4mL/min;柱溫為85℃;進(jìn)樣量為10μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 Thermotoga lettingae TMO RpiB基因的PCR擴(kuò)增、克隆及鑒定

以Thermotoga lettingae TMO菌液為模板，擴(kuò)增出了一條約450bp的條帶，與預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物大小吻合(圖1)。測(cè)序結(jié)果與NCBI(登錄號(hào):ABV32911.1)中的已知基因完全吻合。

圖1 Thermotoga lettingae TMO RpiB基因的PCR擴(kuò)增片段檢測(cè)Fig.1 Analysis of Thermotoga lettingae TMO RpiB amplied by PCR

分別用Xho I單酶切質(zhì)粒pET－22b(+)和重組質(zhì)粒 pET22b－tl－rpib，用 Nde I、Xho I雙酶切重組質(zhì)粒pET22b－tl－rpib(圖2)。雙酶切重組質(zhì)粒得到兩個(gè)片段，其中大片段與線性pET－22b(+)大小相當(dāng)，450bp有一微弱條帶為小片段，與編碼Thermotoga lettingae TMO RpiB基因大小相同，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 重組質(zhì)粒pET22b－tl－rpib的酶切鑒定Fig.2 Restriction enzymatic analysis of recombinant plasmid pET22b－tl－rpib

2.2 基因工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)

為了獲得大量目的蛋白，選擇誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度三個(gè)因素對(duì)重組菌 E.coli BL21/pET22b－tl－rpib的誘導(dǎo)表達(dá)進(jìn)行了優(yōu)化。表達(dá)產(chǎn)物SDS－PAGE分析結(jié)果顯示約在17ku處有明顯特征條帶(圖3)，與重組蛋白分子量的理論計(jì)算值相符。28℃誘導(dǎo)獲得的目的蛋白明顯多于20℃誘導(dǎo)獲得的目的蛋白，而隨著誘導(dǎo)劑濃度增加目的蛋白表達(dá)量增加的趨勢(shì)在兩個(gè)溫度是一樣的(圖3a)。在酶活測(cè)定中，28℃誘導(dǎo)劑IPTG終濃度為1.0mmol/L時(shí)的酶活要高于2.0mmol/L時(shí)的酶活，可能是因?yàn)檎T導(dǎo)劑濃度較高時(shí)，部分目的蛋白以包涵體形式存在而降低了酶活。在28℃溫度下，1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)6h可達(dá)到最高表達(dá)產(chǎn)物量(圖3b)，6h以后，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，誘導(dǎo)量不再增加，這一結(jié)果與酶活測(cè)定結(jié)果是一致的，可能是培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡，到一定時(shí)間后蛋白質(zhì)分解速度大于合成。

2.3 重組RpiB的分離純化

對(duì)Ni2+－Chelating Sepharose Fast Flow純化后得到目的蛋白進(jìn)行SDS－PAGE分析，其純度達(dá)到電泳純(圖4)。在用50mmol/L pH8.0的磷酸緩沖液對(duì)收集到的目的蛋白進(jìn)行4℃過(guò)夜透析處理時(shí)發(fā)現(xiàn)，蛋白聚集沉淀現(xiàn)象較明顯，采用Sephdex G25脫鹽柱快速脫鹽可避免這一現(xiàn)象。分析其原因，可能是因?yàn)樵摰鞍滓远垠w形式存在，其存在形式與聚集狀態(tài)易受pH、離子強(qiáng)度的影響。在透析脫鹽過(guò)程中，含目的蛋白的溶液體系中咪唑含量不斷減少使體系pH持續(xù)變化，離子強(qiáng)度也在不斷下降，且透析處理所需時(shí)間較長(zhǎng)，這些都可能導(dǎo)致重組蛋白不穩(wěn)定而聚集沉淀。G25脫鹽柱充分平衡后進(jìn)行脫鹽，能夠提供較為穩(wěn)定的溶液環(huán)境，且在較短的時(shí)間內(nèi)完成了目的蛋白緩沖液的置換，可以緩解蛋白的沉淀。而影響該重組蛋白存在形式與聚集狀態(tài)的具體因素、聚集作用機(jī)理等，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

圖3 重組質(zhì)粒pET22b－tl－rpib在E.coli BL21(DE3)中的表達(dá)Fig.3 pET22b－tl－rpib expression in E.coli BL21(DE3)

圖4 SDS－PAGE電泳分析純化后的目的蛋白Fig.4 SDS－PAGE analysis of the purified target protein

2.4 產(chǎn)D－阿洛糖活性鑒定

工程菌E.coli BL21/pET22b－tl－rpib的靜息細(xì)胞(圖5b)及分離純化得到的Thermotoga lettingae TMO RpiB(圖5c)均可催化D－阿洛酮糖轉(zhuǎn)化成D－阿洛糖。相當(dāng)量的純化后的重組 Thermotoga lettingae TMO RpiB的底物轉(zhuǎn)化率(23%)要高于工程菌E.coli BL21/pET22b－tl－rpib的靜息細(xì)胞的底物轉(zhuǎn)化率(19%)，可能是因?yàn)镈－阿洛糖可以參與E.coli的磷酸戊糖支路的代謝［18］而被消耗掉了一部分。兩者都具有產(chǎn)D－阿洛糖的生物活性，而利用工程菌E.coli BL21/pET22b－tl－rpib的靜息細(xì)胞進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化時(shí)，無(wú)需復(fù)雜的蛋白質(zhì)提取、分離純化過(guò)程，且底物轉(zhuǎn)化率也較為可觀，有生產(chǎn)操作的可行性，可以作為功能性稀有糖D－阿洛糖的生產(chǎn)用生物催化劑，應(yīng)該在后續(xù)的工作中深入研究。

圖5 重組Thermotoga lettingae TMO RpiB的酶活鑒定Fig.5 Enzyme activity analysis of the recombinant Thermotoga lettingae TMO RpiB

3 結(jié)論

D－阿洛糖是一種具有重要生理功能及應(yīng)用前景的稀有糖，在自然界存在量稀少，而化學(xué)合成法副產(chǎn)物多，污染大。生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)D－阿洛糖技術(shù)的出現(xiàn)，使這種具有抑癌功能的稀有糖之大規(guī)模生產(chǎn)成為可能。

本研究以Thermotoga lettingae TMO的基因組DNA為模版，通過(guò)菌液PCR及基因克隆技術(shù)獲得了工程菌 E.coli BL21/pET22b－tl－rpib。在 28℃溫度下，添加1mmol/L的IPTG，誘導(dǎo)6h，表達(dá)產(chǎn)物達(dá)到最大量。經(jīng)親和層析純化的蛋白酶液進(jìn)行SDS－PAGE電泳分析，約在17ku處出現(xiàn)單一特征條帶，證明了Thermotoga lettingae TMO RpiB在大腸桿菌中得到了正確的表達(dá)。同時(shí)對(duì)重組Thermotoga lettingae TMO RpiB催化D－阿洛酮糖生成D－阿洛糖的活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在 55℃條件下，工程菌 E.coli BL21/pET22b－tl－rpib的靜息細(xì)胞催化反應(yīng)3h后轉(zhuǎn)化率可達(dá)19%，說(shuō)明該工程菌有希望用于生物轉(zhuǎn)化法大規(guī)模生產(chǎn)新型功能性稀有糖D－阿洛糖。

定點(diǎn)突變技術(shù)可以大幅提高RpiB的催化效率［17］。下一步我們將對(duì) Thermotoga lettingae TMO RpiB的催化機(jī)理進(jìn)行研究，并嘗試定點(diǎn)突變結(jié)合相關(guān)基團(tuán)，改變酶與底物結(jié)合的強(qiáng)度，從而進(jìn)一步提高酶活，得到更高效的產(chǎn)D－阿洛糖生物催化劑。

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