萬(wàn)秋霞，王威威，劉冬冬，劉天華，全麗妮

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科，黑龍江哈爾濱 150086)

腦缺血后再灌注(ischemia reperfusion，IR)可加重缺血細(xì)胞的損傷，甚至導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。研究表明電針刺激穴位對(duì)腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，取得了比較滿意的效果［1-2］。預(yù)處理可以減輕再灌注損傷，保護(hù)組織器官，該領(lǐng)域研究正不斷深入。針刺是否能作為一種預(yù)處理方式，目前國(guó)內(nèi)外極少有人研究［3］。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠全腦缺血模型，首次提出通過(guò)觀察電針預(yù)處理大鼠“百會(huì)”(Du20)與“水溝”(Du26)穴對(duì)腦缺血再灌注后頸靜脈血糖及腦組織含水量的影響，初步揭示電針預(yù)處理的腦保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康雄性 Winster大鼠90只，體質(zhì)量250～300 g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，在控溫(23±1)℃，標(biāo)準(zhǔn)明-暗周期飼養(yǎng)(明期6:00～18:00)環(huán)境下自由飲水覓食。經(jīng)過(guò)5 d適應(yīng)期后隨機(jī)分為假手術(shù)組(SH組)，腦缺血再灌注組(IR組)，電針預(yù)處理加腦缺血再灌注組(EA組)，每組30只。并按照缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)再進(jìn)一步細(xì)分為2、6、24 h三個(gè)亞組，每組10只。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過(guò)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 動(dòng)物模型的建立

參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法［4-5］加以改進(jìn)，即采用阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈合并低血壓方法建立大鼠腦缺血再灌注模型。麻醉前禁食12 h。腹腔注射10%的水合氯醛(350 mg/kg)麻醉后，經(jīng)口氣管插管后，動(dòng)物仰臥固定，接呼吸機(jī)，機(jī)械通氣，定時(shí)血?dú)夥治鲆哉{(diào)整呼吸頻率、潮氣量，使呼吸末二氧化碳分壓(PetCO2)和動(dòng)脈血pH保持在生理范圍。頸部去毛，70%酒精棉球消毒，頸部正中切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，分別穿線以方便提起。雙側(cè)腹股溝部切口，分離股動(dòng)脈，左股動(dòng)脈置管用于采血樣、監(jiān)測(cè)血壓，右股動(dòng)脈置管用于放血和血液回輸。SH組僅暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈及股動(dòng)脈置管，麻醉和手術(shù)步驟同腦缺血再灌注組，只是不夾閉左右頸總動(dòng)脈，不回抽血液。其余組用肝素化的注射器自右股動(dòng)脈抽血，使MAP降至35～40 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)時(shí)，用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈15 min，缺血期間通過(guò)抽吸股動(dòng)脈血維持MAP 35 mmHg～40 mmHg。同時(shí)雙側(cè)顳部頭皮插入電極描記腦電波，大鼠在缺血10～15 s時(shí)腦電圖即可變?yōu)榈入娢唬膳袛酁槟X缺血模型建立。缺血15 min后去除兩側(cè)頸總動(dòng)脈上動(dòng)脈夾并將血液回輸完成再灌注。術(shù)中使用恒溫電熱毯維持直腸溫37℃ ～38℃。

1.3 電針預(yù)處理

電針預(yù)處理組在腦缺血前給予電針刺激。參考全國(guó)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》教材取大鼠“百會(huì)”(Du20)與“水溝”(Du26)穴。用直徑為0.40 mm、長(zhǎng)25 mm的華佗牌不銹鋼毫針，“百會(huì)”頂骨正中向前刺入2 mm，“水溝”唇裂鼻尖下1 mm正中處直刺入1 mm，至針下出現(xiàn)沉緊感時(shí)接通上海產(chǎn)G6805電針儀，用疏密波，頻率2/15 Hz，強(qiáng)度(電流)1 mA，刺激強(qiáng)度以大鼠頭部輕微抖動(dòng)為度，持續(xù)30 min。

1.4 腦組織含水量測(cè)定

將各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在規(guī)定的各時(shí)間點(diǎn)斷頭處死，取腦組織，濾紙吸干腦表面水分，用預(yù)先稱重編號(hào)，錫紙包裹，先用電子天平稱取腦組織濕重，然后將包好的腦組織放入95℃恒溫烤箱內(nèi)烘干24 h至恒重，取出待測(cè)腦組織恢復(fù)到室溫后稱取其干重。計(jì)算腦組織含水量=(濕重－干重)/濕重×100%。

1.5 頸靜脈血糖的測(cè)定

血糖測(cè)定采用德國(guó)羅氏血糖測(cè)定儀，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)取一滴頸靜脈血，即刻用血糖儀測(cè)定血糖含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組資料可比性

SH組、IR組、EA組大鼠體質(zhì)量、血?dú)庵怠R、MAP、血糖基礎(chǔ)水平等指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、血?dú)庵?、HR、MAP、血糖基礎(chǔ)值Tab.1 Physiological values measured in 3 groups of rats (n=30，±s)

表1 各組大鼠體質(zhì)量、血?dú)庵怠R、MAP、血糖基礎(chǔ)值Tab.1 Physiological values measured in 3 groups of rats (n=30，±s)

項(xiàng)目 SH組 IR組 E組體質(zhì)量/g 281±15 276±12 377±13 pH 7.41 ±0.05 7.41 ±0.02 7.42 ±0.16 PaCO2/mmHg 40.6 ±3.2 40.1 ±2.9 39.8 ±3.1 PaO2/mmHg 482±17 483±23 487±25 HCO－3/(mmol·L －1)24.2 ±1.4 24.2 ± 1.1 23.5 ± 1.6 HR/(次·min－1) 350±20 353±17 346±18 MAP/mmHg 123±3 121±11 125±10血糖/(mmol·L －1)4.3 ±0.66 4.46 ±0.61 4.41 ±0.58

2.2 缺血大鼠腦電圖變化

建立缺血大鼠模型腦電圖均出現(xiàn)變化，大鼠在缺血10～15 s時(shí)腦電圖均可由缺血前腦電圖(圖1A)變?yōu)榈入娢?圖1B)，可判斷為腦缺血模型建立。

圖1 大鼠腦缺血前后腦電圖波形Fig.1 Electroencephalogram of rat before and after cerebral ischemia

2.3 腦組織含水量變化

IR組和SH組以及EA組的含水量在術(shù)后2 h無(wú)明顯差別。IR組和EA組腦含水量在再灌注后6 h顯著升高，48 h達(dá)到高峰，與SH組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與IR組比較，電針預(yù)處理組在再灌注后6 h和24 h腦含水量顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見(jiàn)表2。

2.4 頸靜脈血糖的變化

和SH組對(duì)比，EA組和IR組在再灌注后2 h血糖明顯升高，6 h達(dá)到最高值，至24 h有所回落，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與IR組比較，EA組在再灌注2、6 h和24 h血糖值顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠各個(gè)時(shí)間點(diǎn)血糖、腦組織含水量的比較Tab.2 Comparison of blood glucose and brain water content in 3 groups at different time points (n=30，±s)

表2 各組大鼠各個(gè)時(shí)間點(diǎn)血糖、腦組織含水量的比較Tab.2 Comparison of blood glucose and brain water content in 3 groups at different time points (n=30，±s)

與 SH組比較，(1)P ＜0.01;與 IR 組比較，(2)P＜0.01

組別 血糖/(mol·L－1) 腦組織含水量/%2h 6h 24h 2h 6h 24h SH 組 4.56 ±0.55 4.54 ±0.57 4.20 ±0.52 77.38 ±0.20 77.42 ±0.19 77.37 ±0.24 IR 組 7.17 ±0.57(1) 8.73 ±0.47(1) 7.23 ±0.45(1) 77.33 ±0.26 79.36 ±0.27(1) 81.20 ±0.46(1)EA 組 6.27 ±0.56(1)(2) 7.53 ±0.36(1)(2) 6.27 ±0.54(1)(2) 77.29 ±0.16 78.31 ±0.16(1)(2)79.23 ±0.33(1)(2)

3 討 論

臨床上處理腦缺血性損傷的原則是盡早恢復(fù)血液再灌注，然而缺血后的血流恢復(fù)在某些情況下能導(dǎo)致進(jìn)一步的組織損傷和功能障礙，即缺血/再灌注損傷。腦缺血-再灌注損傷后高血糖反應(yīng)和腦水腫的發(fā)生是導(dǎo)致患者病情加重甚至死亡的常見(jiàn)原因。有報(bào)道認(rèn)為［6］，急性顱腦損傷患者會(huì)發(fā)生不同程度的高血糖癥，且患者的預(yù)后與高血糖水平成正相關(guān)。如何防治腦缺血再灌注后血糖的升高和腦水腫的發(fā)生是近年來(lái)愈來(lái)愈受到重視的研究課題之一。

腦缺血后血糖升高的發(fā)生機(jī)制和血糖的變化規(guī)律目前仍不清楚，可能與應(yīng)激和激素水平的變化等因素有關(guān)［7-8］。本實(shí)驗(yàn)中大鼠腦缺血再灌注后2 h血糖顯著升高，6 h達(dá)到高峰，24 h有所下降，維持在一個(gè)較高水平。這可能是大鼠腦缺血再灌注后，機(jī)體由于應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致應(yīng)激激素分泌增多，胰島素分泌減少，葡萄糖攝入下降，同時(shí)受損的腦細(xì)胞代謝降低，對(duì)糖的攝取和利用降低，最終導(dǎo)致血糖升高。

本研究發(fā)現(xiàn)電針預(yù)處理大鼠在缺血再灌注后血糖也升高，但較缺血再灌注組顯著減少，表明電針預(yù)處理對(duì)缺血再灌注損傷導(dǎo)致血糖升高有調(diào)理作用，有效提高受損腦細(xì)胞的代謝水平，增加腦細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和利用，對(duì)腦組織能量代謝的恢復(fù)具有明顯的促進(jìn)作用，有利于缺血性腦損傷的盡快康復(fù)。

在以往使用大鼠進(jìn)行電針實(shí)驗(yàn)的研究過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)對(duì)象多數(shù)是在清醒的狀態(tài)下進(jìn)行針灸或電針干預(yù)，常常導(dǎo)致動(dòng)物在接受治療的同時(shí)處于應(yīng)激狀態(tài)，嚴(yán)重影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。為了排除電針干預(yù)引起的應(yīng)激反應(yīng)，本研究中均給大鼠麻醉，避免電針針刺本身對(duì)大鼠血糖的干擾。

腦水腫是腦缺血再灌注后的基本病理變化之一，是一個(gè)復(fù)雜的多因素過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)中觀察到缺血再灌注后2 h腦含水量沒(méi)有顯著性變化，6 h含水量顯著增加，至24 h達(dá)到高峰，說(shuō)明腦缺血再灌注后腦水腫逐漸加重。水通道蛋白4 AQP4是水通道蛋白家族中的一員，AQP4對(duì)水分子有高通透性，是腦內(nèi)調(diào)控水分子進(jìn)出的重要的水通道蛋白［9-10］。腦缺血再灌注后腦水腫的發(fā)生與AQP-4的表達(dá)及其在血管周邊的分布變化密切相關(guān)［11］。有研究表明［11-12］，在缺血再灌注早期(6 h)，AQP4蛋白表達(dá)及其在血管周邊的密度均升高，而在缺血再灌注24 h后，雖然其總蛋白的表達(dá)進(jìn)一步上升，但其在血管周邊的分布卻明顯下降，直接影響了水腫的消散，造成腦缺血后腦腫脹的加劇。本研究結(jié)果表明，缺血再灌注后6 h和24 h腦水含量的變化支持這一理論，但具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

有研究表明［12］，在再灌注6 h，電針組AQP4在血管周邊的密度減少，而在再灌注后24 h，電針組的AQP4在血管周邊的密度顯著升高。由此推測(cè)，電針干預(yù)能減緩早期細(xì)胞性水腫的生成，促進(jìn)了晚期水腫的消散。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，電針預(yù)處理后雖不能完全控制腦水腫，但可以在缺血再灌注后6 h、24 h明顯降低腦組織含水量，減輕腦水腫，表明電針預(yù)處理能顯著減少大鼠腦缺血再灌注后腦組織含水量，減輕再灌注后腦水腫的程度，對(duì)腦組織具有保護(hù)作用。電針預(yù)處理對(duì)AQP-4分布的影響在多大程度上參與了電針的抗缺血再灌注損傷，還需進(jìn)一步的深入研究。

有研究報(bào)道［6］，缺血再灌注后腦水腫和血糖升高是相輔相成的。本實(shí)驗(yàn)中觀察到大鼠血糖在再灌注后2 h升高，腦組織含水量在再灌注后6 h升高，血糖升高較腦水腫早發(fā)生，這也說(shuō)明高血糖可能促進(jìn)了腦水腫的發(fā)生，腦缺血再灌注晚期腦水腫達(dá)到高峰可能又促進(jìn)了血糖升高。

本研究顯示，電針預(yù)處理能夠顯著降低腦缺血再灌注后大鼠出現(xiàn)的高血糖，同時(shí)可以降低腦組織的含水量，從而減輕腦缺血再灌注損傷，實(shí)現(xiàn)對(duì)中樞神經(jīng)元的保護(hù)作用。這一初步研究結(jié)果具有一定的臨床應(yīng)用前景，其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步揭示。

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