袁榮高，楊留才，劉德軍，李仕紅，徐紅濤

(1．連云港中醫(yī)藥高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校，連云港 222006；2．鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，鹽城 224006)

靈芝多糖對(duì)糖尿病大鼠腎臟保護(hù)作用機(jī)制研究*

袁榮高1，楊留才2，劉德軍1，李仕紅2，徐紅濤2

(1．連云港中醫(yī)藥高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校，連云港 222006；2．鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，鹽城 224006)

目的研究靈芝多糖對(duì)糖尿病(DM)模型大鼠腎臟保護(hù)作用及分子機(jī)制。方法建立DM大鼠模型,分為對(duì)照組、模型組和藥物治療組,藥物治療組用靈芝多糖治療8周。觀察3組大鼠腎功能指標(biāo)、氧化-抗氧化指標(biāo)、原位末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測(cè)腎臟細(xì)胞凋亡,Western-blot檢測(cè)Bcl-2、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)和Bax在腎臟的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果藥物治療組的腎功能指標(biāo)好于模型組,低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);藥物治療組腎皮質(zhì)的丙二醛(MDA)低于模型組,高于對(duì)照組;超氧化物歧化酶(SOD)高于模型組,低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);藥物治療組腎臟細(xì)胞凋亡率低于模型組,高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);藥物治療組腎皮質(zhì)的Bcl-2蛋白表達(dá)水平高于模型組,低于對(duì)照組,BAX和TGF-β1蛋白表達(dá)水平低于模型組,高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論靈芝多糖可能通過(guò)改善DM大鼠氧化應(yīng)激水平和抑制腎臟細(xì)胞凋亡保護(hù)DM大鼠的腎功能。

靈芝多糖；糖尿??；氧化應(yīng)激；凋亡

糖尿病(diabetesmellitus,DM)是中老年人高發(fā)的一種慢性非感染性疾?。?］,其臨床表現(xiàn)為以高血糖為主的臨床綜合征［2-3］。DM隨著病程的進(jìn)展,會(huì)對(duì)體內(nèi)如腎臟、視網(wǎng)膜等多個(gè)器官造成損害,導(dǎo)致產(chǎn)生DM眼病、2型糖尿病腎病等多種嚴(yán)重的并發(fā)癥,其中糖尿病腎病是上述并發(fā)癥中最嚴(yán)重的一種,往往會(huì)因?yàn)槟I臟功能的衰竭而導(dǎo)致患者死亡［4］。研究表明,糖尿病患者的體內(nèi)氧化-抗氧化平衡被破壞,氧化應(yīng)激水平增高,從而對(duì)腎臟等多個(gè)器官造成損傷［5］。通過(guò)對(duì)DM動(dòng)物模型使用抗氧化劑a-硫辛酸能夠有效降低氧化應(yīng)激水平,減少腎臟損傷［6］。研究表明,靈芝中的主要藥理成分為靈芝多糖(ganoderma lucidumpolysaccharides,GLPs),通過(guò)對(duì)GLPs的藥理作用研究發(fā)現(xiàn),GLPs具有清除體內(nèi)自由基的作用,從而發(fā)揮抗氧化和延緩衰老等功能。同時(shí),研究還發(fā)現(xiàn),GLPs能夠改善DM大鼠胰島細(xì)胞的凋亡［7］。筆者研究GLPs對(duì)DM大鼠腎臟是否有保護(hù)作用,并且探討其機(jī)制,從而為選擇治療糖尿病腎病的藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康雄性Wistar大鼠,8周齡,體質(zhì)量200～220 g,南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(蘇)2002-0022。

1.2 試藥與材料 靈芝多糖(江蘇安惠生物科技有限公司,批號(hào):120601)；鏈脲佐菌素,高脂飲食(飼料配方為脂肪25%、蛋黃粉5%、基礎(chǔ)飼料70%,南通特洛菲飼料科技有限公司生產(chǎn))。血液尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、肌酐(creatinine,Cr)、丙二醛(malonaldehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒,購(gòu)于南京建成生物工程研究所。TUNEL試劑盒(瑞士羅氏公司生產(chǎn))；鼠源單克隆多克隆Bcl-2抗體(1∶500)、鼠源單克隆Bax抗體(1∶500),鼠源單克隆轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)抗體(1∶500)均購(gòu)于美國(guó)Merck公司,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)志羊抗鼠二抗(1∶4 000,美國(guó)Sigma公司)。

1.3 2型糖尿病大鼠動(dòng)物模型的制作 選擇8周齡健康雄性Wistar大鼠40只,按照文獻(xiàn)［8］制作2型糖尿病模型。按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為2組,其中1組10只大鼠,作為正常組；另一組大鼠30只,從左下腹腔單次注射鏈脲佐菌素溶液65 mg·kg-1,禁食48 h后經(jīng)尾尖取血測(cè)空腹血糖,以血糖≥11.1 mmol·L-1作為DM模型制作成功。30只大鼠中28只建模成功,將28只建模成功大鼠隨機(jī)均分為模型組和藥物治療組,每組大鼠14只。其中藥物治療組每日使用靈芝多糖400 mg·kg-1經(jīng)食管灌注,持續(xù)10周。3組大鼠均予以高脂飲食。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到10周時(shí),所有實(shí)驗(yàn)組大鼠均在空腹下腹腔注射水合氯醛進(jìn)行麻醉,分離雙腎,左腎用多聚甲醛進(jìn)行固定,右腎取腎皮質(zhì)于-80℃保存用于氧化-抗氧化指標(biāo)檢測(cè)和Western-blot實(shí)驗(yàn)。

1.5 測(cè)定指標(biāo)

1.5.1 血腎功能指標(biāo) 在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到第10周時(shí),代謝籠收集24 h尿液,使用免疫比濁法測(cè)定3組24 h尿蛋白(24 h urinary albumin,24 hUAlb)含量。大鼠心臟采血后處死,使用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定3組血液中尿BUN、Cr濃度。

1.5.2 氧化-抗氧化指標(biāo)檢測(cè) 取部分冷凍保存的腎皮質(zhì),制備成10%組織勻漿,使用硫代巴比妥酸法測(cè)定血漿MDA,用二硫代二硝基苯甲酸比色法測(cè)定紅細(xì)胞SOD活性。

1.5.3 TUNEL檢測(cè) 使用多聚甲醛固定的腎臟經(jīng)過(guò)常規(guī)脫水、石蠟包埋,以5 mm連續(xù)切片,常規(guī)脫蠟水化,按照TUNEL試劑盒的要求進(jìn)行操作。在光鏡下觀察以細(xì)胞核被染成棕色作為陽(yáng)性細(xì)胞,統(tǒng)計(jì)在高倍鏡視野下的陽(yáng)性率。

1.5.4 Bcl-2、Bax和TGF-β1的western-blot檢測(cè) 大鼠腎臟提取蛋白后110 V恒壓電泳2 h,恒流0.3 A轉(zhuǎn)移60 min。以鼠源單克隆多克隆Bcl-2抗體(1∶500)、鼠源單克隆Bax抗體(1∶00)和鼠源單克隆TGF-β1抗體(1∶500)分別在4℃下孵育過(guò)夜,使用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)進(jìn)行反復(fù)沖洗5 min,使用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)志羊抗鼠二抗(1∶4 000)室溫孵育1 h,將ChemiluminescentSubstrate kit A液和B液各300 mL混合反應(yīng)1 min,進(jìn)行曝光、顯影、定影。掃描分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。使用btubulin作為內(nèi)參對(duì)照。利用圖像分析軟件計(jì)算相對(duì)內(nèi)參對(duì)照的相對(duì)積分光密度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均輸入SPSS 18.0版統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腎功能比較 治療完成10周后對(duì)照組、模型組和藥物治療組的腎功能比較見(jiàn)表1。

表1 3組大鼠腎功能比較Tab.1 Comparison of renal function among three groups of rats ±s

表1 3組大鼠腎功能比較Tab.1 Comparison of renal function among three groups of rats ±s

與對(duì)照組比較,*1P<0.05;與模型組比較,*2P<0.05Comparewith control group,*1P<0.05;Compare withmodel group,*2P<0.05

組別大鼠/只BUN Cr (mmol·L-1) 24 hUAlb/ mg藥物治療組14 9.82±2.87*1*238.95±9.65*1*265.21±17.59*1*2模型組14 14.63±1.49*170.31±16.32*1106.54±21.57*1對(duì)照組10 5.67±0.96 13.14±3.69 9.57±2.17

2.2 大鼠腎皮質(zhì)氧化-抗氧化指標(biāo)比較 10周后對(duì)照組、模型組和藥物治療組的腎皮質(zhì)氧化-抗氧化指標(biāo)見(jiàn)表2。

表2 3組大鼠腎皮質(zhì)氧化-抗氧化指標(biāo)比較Tab.2 Comparison of the oxidation and anti-oxidation index in renal cor tex among three groups of rats ±s

表2 3組大鼠腎皮質(zhì)氧化-抗氧化指標(biāo)比較Tab.2 Comparison of the oxidation and anti-oxidation index in renal cor tex among three groups of rats ±s

與對(duì)照組比較,*1P<0.05;與模型組比較,*2P<0.05Compare with control group,*1P<0.05;Compare with model group,*2P<0.05

組別大鼠/只MDA/ (nmol·mg-1·prot) SOD/ (nU·mg-1)藥物治療組14 2.76±0.57*1*2119.58±12.79*1*2模型組14 3.81±0.79*196.62±15.32*1對(duì)照組10 2.15±0.42 134.75±16.23

2.3 大鼠腎臟凋亡情況比較 通過(guò)對(duì)3組大鼠的腎臟皮質(zhì)進(jìn)行TUNEL染色,結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組的TUNEL染色細(xì)胞陽(yáng)性率為(10.26±3.15)%,藥物治療組為(23.56±6.87)%,模型組為(34.87±12.35)%,對(duì)照組細(xì)胞陽(yáng)性率低于藥物治療組和模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),藥物治療組的凋亡細(xì)胞陽(yáng)性率低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.4 大鼠腎皮質(zhì)Bcl-2和Bax蛋白水平表達(dá)比較 對(duì)照組、藥物治療組和模型組的Bcl-2和Bax蛋白水平比較見(jiàn)表3,圖2。

3 討論

本研究通過(guò)建立DM大鼠模型觀察2型糖尿病腎臟的損害,并且觀察靈芝多糖是否能夠保護(hù)DM對(duì)腎臟的損害,并探討其機(jī)制。本研究結(jié)果表明,DM大鼠的血BUN、Cr和UEAR均高于正常大鼠,而經(jīng)過(guò)靈芝多糖處理的DM大鼠血BUN、Cr和UEAR均高于正常大鼠,并且DM腎臟TGF-β1蛋白表達(dá)水平高于正常大鼠,并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。DM對(duì)腎功能能夠造成一定的損傷,并且靈芝多糖能夠在一定程度上保護(hù)DM大鼠的腎功能。研究表明,DM能夠?qū)е卵趸?抗氧化平衡發(fā)生紊亂,導(dǎo)致體內(nèi)氧化應(yīng)激水平明顯提高,脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化,導(dǎo)致腎臟、視網(wǎng)膜等器官發(fā)生病變［9］。2型糖尿病大鼠腎皮質(zhì)的MDA明顯增高,而SOD明顯降低,在經(jīng)過(guò)靈芝多糖處理后,MDA較未經(jīng)處理的DM大鼠降低,而SOD則明顯增高,并且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MDA是自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)的氧化終產(chǎn)物,引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合,具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性［10］,MDA的量常常反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度,間接反映出細(xì)胞損傷的程度［11］。而SOD則是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶［12］,廣泛分布于各種生物體內(nèi)［13］,其主要的生理活性是清除生物體內(nèi)自由基［14］。本研究結(jié)果不僅和上述的研究結(jié)果基本一致,還證明靈芝多糖能夠有效地恢復(fù)原本已經(jīng)紊亂的DM大鼠的氧化-抗氧化平衡。

圖1 3組大鼠腎皮質(zhì)細(xì)胞凋亡水平比較(×400)A.對(duì)照組;B.藥物治療組;C.模型組Fig.1 Comparison of cell apoptosis in renal cortex among three groups of rats(×400)A.control group;B.drug treatment group;C.model group

表3 3組大鼠腎皮質(zhì)Bcl-2、Bax和TGF-β1蛋白水平表達(dá)相對(duì)積分吸光度值比較Tab.3 Comparison of relative integral optical density value of Bcl-2,Bax and TGF-β1protein expression in renal cortex among three groups of rats %,±s

表3 3組大鼠腎皮質(zhì)Bcl-2、Bax和TGF-β1蛋白水平表達(dá)相對(duì)積分吸光度值比較Tab.3 Comparison of relative integral optical density value of Bcl-2,Bax and TGF-β1protein expression in renal cortex among three groups of rats %,±s

與對(duì)照組比較,*1P<0.05;與模型組比較,*2P<0.05Compare with control group,*1P<0.05;Compare with model group,*2P<0.05

組別大鼠/只Bcl-2 Bax TGF-β1藥物治療組14 154.23±33.57*1*2245.18±40.21*1*279.65±20.57*1*2模型組14 102.35±19.87*1331.45±54.21*1213.68±31.59*1對(duì)照組10 234.87±45.62 125.64±22.31 32.56±6.26

圖2 各組大鼠腎皮質(zhì)Bcl-2、Bax和TGF-β1蛋白水平表達(dá)比較A.對(duì)照組;B.藥物治療組;C.模型組Fig 2 Comparison of Bcl-2,Bax and TGF-β1protein expression levels in renal cortex among three groups of ratsA.control group;B.drug treatment group;C.model group

此外,TUNEL染色研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn),DM大鼠腎皮質(zhì)的細(xì)胞凋亡率明顯增高,經(jīng)過(guò)CLPs處理后,其細(xì)胞凋亡率有所降低。DM大鼠腎皮質(zhì)細(xì)胞發(fā)生凋亡的主要原因在于MDA等氧化產(chǎn)物對(duì)腎小球細(xì)胞的損害,導(dǎo)致腎小球細(xì)胞發(fā)生凋亡。為了進(jìn)一步探明其機(jī)制,通過(guò)western-blot的手段檢測(cè)腎皮質(zhì)內(nèi)的Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),DM大鼠的Bcl-2較正常大鼠明顯下調(diào),而B(niǎo)ax則明顯上調(diào)。經(jīng)過(guò)CLPs處理后,DM大鼠Bcl-2較未經(jīng)處理的DM大鼠有所上調(diào),而 Bax則有所下調(diào)。Bcl-2基因(即B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因)是一種原癌基因,它具有抑制凋亡的作用,最初在血液淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Bcl-2能抑制細(xì)胞死亡［15-16］,隨后陸續(xù)在其他一些細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)Bcl-2也具有抑制凋亡的作用［17］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Bcl-2的過(guò)度表達(dá)可減少氧自由基的產(chǎn)生和脂質(zhì)過(guò)氧化物的形成［18］,此外,Bcl-2還可以抑制Cyt c的釋放,從而抑制超氧陰離子的產(chǎn)生［15］。此外,Bcl-2還可以通過(guò)抑制鈣離子跨膜流動(dòng)等方式抑制細(xì)胞凋亡［19］。Bax是Bcl家族成員之一,但是其主要的生理功能和Bcl-2相反, Bax能夠和Bcl-2結(jié)合形成同源二聚體來(lái)促進(jìn)細(xì)胞的凋亡［20］。本研究結(jié)果也顯示,CLPs能夠通過(guò)上調(diào)Bcl-2和下調(diào)Bax的蛋白表達(dá)水平減少腎小球細(xì)胞的凋亡。本研究結(jié)果表明,CLPs一方面通過(guò)提高SOD活性,降低過(guò)高的MDA水平,維持機(jī)體的氧化與抗氧化平衡；另一方面通過(guò)促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá)同時(shí)抑制Bax蛋白表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的比例,保護(hù)DM大鼠的腎功能。

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DOI 10.3870/yydb.2014.02.003

Kidney Protective Effect of Ganoderma LucidumPolysaccharide in Diabetic Rats

YUAN Rong-gao1,YANG Liu-cai2,LIU De-jun1,LI Shi-hong2,XU Hong-tao2
(1.Lianyungang High Vocational and Technical School of Chinese Medicine,Lianyungang 222006,China;2.Yancheng Health Vocational and Technical College,Yancheng 224006,China)

Objective To study the effects of the polysaccharides of Ganoderma lucidumon the kidneys of diabetes mellitus(DM)rats and the related molecularmechanism.MethodsThe DMratmodel was established.The DMrats were divided into control group,model group and treatment group.The treatment group was treated by Ganoderma lucidumpolysaccharides for 8 weeks.The rat renal function profile,oxidation and anti-oxidation index were determined.TUNEL assay method was used for the detection of renal cell apoptosis.The expression levels of Bcl-2,TGF-β1and Bax in the kidney were determined byWestern blotting.ResultsAfter treatmentwith Ganoderma lucidumpolysaccharide,renal function profile in the treatment group was significantly better than that in themodel group,and worse than that in the control group(bothP<0.05). Renal cortical MDA of treatment group was significantly lower than that ofmodel group,and higher than that of the control group (bothP<0.05).SOD of the treatment group was significantly higher than that of the model group,and lower than that of the control group(bothP<0.05).Renal cell apoptosis rate of the treatment group was significantly lower than that of themodel group,and higher than that of the control group(bothP<0.05).Renal cortical Bcl-2 expression level of the treatment group was significantly higher than that ofmodel group,and lower than that of the control group(bothP<0.05).The expression levels ofBAX and TGF-β1protein of the treatment group were significantly lower than those in themodel group,and higher than those of the control group(bothP<0.05).ConclusionGanoderma lucidumpolysaccharidesmay improve oxidative stress and inhibit renal apoptosis of renal cells to protect the renal function of DMrats.

Ganoderma lucidumpolysaccharide;Diabetesmellitus;Oxidative stress;Apoptosis

R965

A

1004-0781(2014)02-0144-05

2013-03-12

2013-05-08

*鹽城市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(YK2010112)

袁榮高(1969-),男,江蘇鹽城人,副教授,學(xué)士,研究方向:衰老的相關(guān)性基因研究。電話:(0) 15961398118,E-mail：15961398118@163.com。

楊留才(1967-),男,江蘇鹽城人,教授,學(xué)士,研究方向:疾病相關(guān)基因研究。電話:(0)13851083108,E-mail：jsyc.ylc@163.com。