趙世印，邱華，賀琴，李德梅，譚華炳

(1．湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院感染性疾病科、肝病研究室，十堰 442000；2．湖北省房縣紅塔鎮(zhèn)衛(wèi)生院內(nèi)科，房縣 442100)

絞股藍(lán)皂苷對2型糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病模型大鼠肝纖維化影響*

趙世印1，2，邱華1，2，賀琴1，李德梅1，譚華炳1

(1．湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院感染性疾病科、肝病研究室，十堰 442000；2．湖北省房縣紅塔鎮(zhèn)衛(wèi)生院內(nèi)科，房縣 442100)

目的觀察絞股藍(lán)皂苷(GPS)對2型糖尿病(T2DM)合并非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠肝纖維化的影響。方法通過高脂飼養(yǎng)聯(lián)合鏈脲佐菌素注射建立T2DM并發(fā)NAFLD模型(M組)、NAFLD模型(NM組),T2DM并發(fā)NAFLD模型給予GPS(1 g·kg-1·d-1)(JH組),GPS(0.5 g·kg-1·d-1)干預(yù)(JL組)。定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)檢測肝組織α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA);檢測血糖(BG)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、透明質(zhì)酸(HA)的變化;免疫組化染色檢測肝組織層粘連蛋白(LN)表達(dá)。結(jié)果肝組織α-SMA表達(dá):以空白對照組(N組)擴(kuò)增倍數(shù)為1計(jì)算,M組為3.17,與N組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);NM組為2.37,與N組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);JH組為2.26,與M組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);JL組為2.63,與JH組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。肝組織LN免疫組織化學(xué)檢測:M組LN沉積最嚴(yán)重,JL與NM組程度相似;JH組LN沉積最輕。HA變化:M組、NM組、JH組、JL組明顯上升,與N組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),JH組、JL組與M組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。血糖水平:JH組(10.86±3.46)mmol·L-1、JL組(14.78±3.39)mmol·L-1,與M組(18.84±4.24)mmol·L-1比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。血TG水平:JH組(1.83±0.56)mmol·L-1、JL組(2.82±0.66)mmol·L-1,與M組(3.97±0.64)mmol·L-1比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。血TC水平:JH組(1.41±0.10)mmol·L-1,JL組(1.49±0.20)mmol·L-1,與M組(1.85±0.12)mmol·L-1比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論GPS能降低T2DM合并NAFLD大鼠肝纖維化程度。

絞股藍(lán)皂苷；糖尿病,2型；肝病,脂肪性,非酒精性；肝纖維化

2型糖尿病(type 2 diabetesmellitus,T2DM)患者非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)檢出率為50.45%［1］；合并NAFLD的T2DM人群發(fā)生心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加［2］；NAFLD被認(rèn)為與至少20%原因不明的肝硬化病例密切相關(guān)［3］；T2DM是肝硬化發(fā)生的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素［4］。研究T2DM合并NAFLD肝纖維化對預(yù)防肝硬化具有重要意義。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSC)在肝纖維化形成過程中具有核心作用。激活的HSC發(fā)生表型轉(zhuǎn)變成為肌成纖維細(xì)胞,特異性表達(dá)α-平滑肌肌動蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA),大量合成細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)(extracematrix,ECM),產(chǎn)生纖維化［5］。透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,HA)、層粘連蛋白(laminin,LN)是肝纖維化的兩個(gè)重要指標(biāo),筆者在本研究中通過定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)檢測肝組織α-SMA、免疫組化檢測肝組織LN、檢測血液HA,觀察絞股藍(lán)皂苷(gypenosides,GPS)對T2DM并發(fā)NAFLD大鼠肝纖維化的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雄性SD大鼠65只,體質(zhì)量220～250 g,由湖北醫(yī)藥學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供,合格證號:SCXK(湘)2009-0004。實(shí)驗(yàn)場地湖北省十堰市實(shí)驗(yàn)動物中心(湖北省實(shí)驗(yàn)動物設(shè)施使用證明號: 00015644)。

1.2 實(shí)驗(yàn)飼料 普通飼料由湖北醫(yī)藥學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供。膽固醇購自北京雙旋生物培養(yǎng)基制品廠。豬油由市售板油自行煉制而成,蛋黃粉由市售雞蛋自行制作。高糖高脂飼料由湖北醫(yī)藥學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心按實(shí)驗(yàn)配方配制使用(配方:78%普通飼料+2.5%膽固醇+8%蛋黃+7%豬油+4.5%蔗糖)。高脂飼料由湖北醫(yī)藥學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)配方配制使用(配方:82.5%普通飼料+2.5%膽固醇+8%蛋黃+7%豬油)。

1.3 材料與設(shè)備 全自動生化檢測儀(瑞士產(chǎn), Roche/Hitache7600),三酰甘油(triglycerides,TG)、膽固醇(cholesterol,TC)、血糖(blood glucose,BG)檢測試劑為公司原裝進(jìn)口試劑。SN-697型全自動雙探頭放射免疫γ計(jì)數(shù)器(上海原子核研究所四環(huán)儀器一廠)；HA、LN試劑購自北京北方生物技術(shù)研究所。冷凍低溫離心機(jī)(上海中科生物醫(yī)學(xué)高科技開發(fā)有限公司, DL-45R-L)。鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)購自Sigma公司。GPS 購自安康東科麥迪森天然藥業(yè)有限公司,純度為98%。肝組織LN免疫組織化學(xué)染色檢查使用武漢谷歌生物科技有限公司全套設(shè)備,LN抗體購自武漢博士德生物工程有限公司(bs0821R)。α-SMA檢測設(shè)備和試劑為武漢谷歌生物科技有限公司全套設(shè)備、試劑。

1.4 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?/p>

1.4.1 實(shí)驗(yàn)動物的分組 大鼠購入后,飼養(yǎng)觀察1周。按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將65只大鼠分為空白對照組(7只,N組),NAFLD模型組(NM組,7只),T2DM并NAFLD模型組(51只)。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)動物的管理 參照文獻(xiàn)［6］,每只鼠每天高糖高脂飼料約20 g,分兩次投入,喂養(yǎng)4周；大鼠隔夜空腹腹腔注射STZ 40 mg·kg-1,48 h后尾靜脈取血,BG>11.1 mmol·L-1,納入實(shí)驗(yàn)組,造模成功率為100%；繼續(xù)給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)至8周,期間大鼠死亡15只。將全部大鼠分為GPS大劑量組(9只,JH組),灌胃給予GPS 1 g·kg-1·d-1；GPS小劑量組(9只,JL組),灌胃給予GPS 0.5 g·kg-1·d-1；T2DM并發(fā)NAFLD模型對照組(9只,M組)灌胃給予同體積的純凈水；繼續(xù)給予高糖高脂飼料,自由飲水；治療周期為6周；實(shí)驗(yàn)周期14周。N組每天給予普通飼料約20 g(根據(jù)NAFLD組進(jìn)食量調(diào)整)；NM組給予高脂飼料約20 g(依據(jù)前1 d進(jìn)食量決定第2天進(jìn)食量)；飼料分2次投入。自由飲水。實(shí)驗(yàn)周期14周。

1.5 標(biāo)本的采集與檢測

1.5.1 血液標(biāo)本的采集與處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),10%水合氯醛腹腔注射麻醉,暴露腹主動脈,經(jīng)腹主動脈采集血液10 mL分別置于肝素管和促凝管,離心取血漿和血清,保存于-20℃的冰柜中待檢。同步按儀器和試劑說明書要求,檢測血漿TG、TC、BG和血清HA、LN。

1.5.2 α-SMA檢測設(shè)備、試劑、方法 總RNA抽提按Trizol說明書進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄(取PCR管,加入含RNA 2μg的溶液；加入1μL oligo(dT)15；用無核糖核酸酶的去離子水補(bǔ)足至12μL；于PCR儀上70℃保溫5 min,迅速置冰上冷卻；依次加入4μL 5×buffer,2μL 10 mmol·L-1dNTPs,RNA inhibitor和反轉(zhuǎn)錄酶各1μL,用移液器抽吸混勻；于PCR儀上42℃保溫30 min,結(jié)束后80℃保溫5 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶)。定量PCR(取0.2 mL PCR管,配制如下反應(yīng)體系,每個(gè)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管,2×qPCR Mix 12.5μL, 2.5μmol·L-1基因引物2.0μL,反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.0μL, ddH2O 8.5μL；取0.2 mL PCR管,配制如下反應(yīng)體系,每個(gè)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管,2×qPCR Mix 12.5μL, 2.5μmol·L-1內(nèi)標(biāo)引物2.0μL,反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.0μL,ddH2O 8.5μL)。PCR擴(kuò)增(預(yù)變性95℃1 min,循環(huán)(40次)95℃,15 s→58℃,20 s→72℃,20 s,末段延72℃5 min,溶解曲線72℃→95℃,每20 s升溫1℃)。結(jié)果處理采用ΔΔCT法。

1.5.3 肝組織免疫組織化學(xué)染色檢測LN 按石蠟切片免疫組織化學(xué)檢測操作常規(guī)進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 9.0版統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,治療前后組內(nèi)及組間比較用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)過程中大鼠數(shù)量 模型組在T2DM并NAFLD造模過程中,死亡大鼠15只,死亡率為29.41%；在干預(yù)過程中,JH組、JL組、M組分別有1, 2,3只大鼠死亡,實(shí)驗(yàn)結(jié)束JH組大鼠8只,JL組7只, M組6只,NM組6只。N組大鼠飼養(yǎng)過程中無死亡。

2.2 HA變化 M組、NM組、JH組、JL組與N組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05),JH組、JL組低于M組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。見表1。

2.3 TG、TC、BG檢測值 M組、NM組、JH組、JL組與N組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；JH組、JL組與M組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

2.4 α-SMA表達(dá)變化 以N組擴(kuò)增倍數(shù)為1計(jì)算,M組為3.17,與N組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；NM組為2.37,與N組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)；JH組表達(dá)降至2.26,與M組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；JL組表達(dá)降至2.63,與JH組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5 肝組織免疫組織化學(xué)染色檢測 M組LN沉積最嚴(yán)重,JL與NM組程度相似；JH組LN沉積最輕。見圖1。

3 討論

肝纖維化是慢性肝病向終末型肝病發(fā)展的必由之路。抑制肝纖維化就是抑制終末型肝病的發(fā)生。近年來,由T2DM、NAFLD等代謝性疾病導(dǎo)致的肝纖維化已經(jīng)成為肝纖維化的主要原因。研究T2DM合并NAFLD具有重要意義。

表1 5組大鼠BG、TG、TC、HA的測定值Tab.1 Determination results of BG,TG,TC and HA in five groups of rats ±s

表1 5組大鼠BG、TG、TC、HA的測定值Tab.1 Determination results of BG,TG,TC and HA in five groups of rats ±s

與N組比較,*1P<0.01,*4P<0.05;與M組比較,*2P<0.01,*3P<0.05Compared with N group,*1P<0.01,*4P<0.05;Compared with Mgroup,*2P<0.01,*3P<0.05

組別大鼠/只BG TG TC (mmol·L-1) HA/ (ng·mL-1) M組6 18.84±4.24*13.97±0.64*11.85±0.12*1280.86±24.24*1NM組6 9.84±3.25*1*22.76±0.72*1*31.47±0.13*3*4204.34±19.56*1*2JH組8 10.86±3.46*1*21.83±0.56*1*21.41±0.10*3*4199.92±18.28*1*2JL組7 14.78±3.39*1*32.82±0.66*1*31.49±0.20*3*4238.26±20.86*1*2N組7 5.65±0.52 0.96±0.09 1.10±0.10 64.12±6.98

圖1 肝組織LN免疫組織化學(xué)染色(×400)N.正常對照組;M.模型組;NM.非酒精性脂肪性肝病組;JH.大劑量GPS干預(yù)組;JL.小劑量GPS干預(yù)組Fig.1 Immunohistochemical staining on Laminin in hepatic tissue(×400)N.normal control group;M.model group;NM.Nonalcoholic fatty liver;JH.model group treated with high-dose GPS;JL.model group treated with low-dose GPS

本研究肝臟病理學(xué)、BG、TG、TC檢測顯示M組、JH組、JL組T2DM并NAFLD模型及NM組NAFLD模型已經(jīng)建立,血糖、血脂檢測顯示GPS大、小劑量均有降低血糖、調(diào)整血脂代謝作用,并呈劑量依賴性［7］；GPS具有劑量依賴性干預(yù)T2DM并發(fā)NAFLD脂肪肝程度的作用。

HSC的激活和增殖,HSC活化是肝纖維化的中心環(huán)節(jié)［8］。α-SMA是HSC活化程度和肝纖維化進(jìn)展的一個(gè)重要指標(biāo)已經(jīng)為學(xué)界所認(rèn)同。本研究顯示,T2DM并發(fā)NAFLD、NAFLD大鼠均有明顯α-SMA表達(dá),JH組、JL組均有降低α-SMA表達(dá)的作用,說明GPS具有抑制HSC激活和增殖,從而抑制纖維化作用。

HA濃度升高被認(rèn)為與HSC合成和分泌增多,及肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(LSEC)攝取和降解功能減退有關(guān),HA是反映LSEC表型發(fā)生改變的標(biāo)志。LN可作為肝竇毛細(xì)血管化基底膜形成的一個(gè)重要標(biāo)志［9］。LSEC是特殊化的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞,在肝竇形成無隔膜、無BM的窗孔(fenestrae),窗孔結(jié)構(gòu)有利于肝細(xì)胞和血液之間進(jìn)行物質(zhì)交換,在維持肝臟結(jié)構(gòu)和實(shí)現(xiàn)各種功能中起著非常重要的作用,HA、LN的升高提示ECM生成增多、吸收減少,肝纖維化加重。肝臟LN免疫組化顯示JH組、JL組LN表達(dá)較M組顯著下降,JH組輕于JL組；血液生化檢驗(yàn)提示與M組比較,JH組、JL組HA、LN下降,具有劑量依賴性。進(jìn)一步說明GPS具有抑制肝纖維化作用。

中醫(yī)認(rèn)為T2DM并發(fā)NAFLD是由于濕熱內(nèi)蘊(yùn)、痰瘀互結(jié),需要清熱解毒。絞股藍(lán)是傳統(tǒng)的清熱解毒藥物?，F(xiàn)代藥理研究證明,絞股藍(lán)含有83種與人參皂苷有類似骨架達(dá)瑪烷型GPS,皂苷具有抗炎、降低血脂、降血糖和免疫調(diào)節(jié)等多方面的生物活性和藥理作用［10］,NORBERG等［11］從絞股藍(lán)中分離提純出一種新的皂苷,存在4種可以相互轉(zhuǎn)化的立體異構(gòu)體,在體外及動物實(shí)驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn),其可刺激胰島細(xì)胞釋放胰島素,且呈現(xiàn)劑量依賴性。XU等［12］對絞股藍(lán)中分離得到的皂苷及其衍生物的降糖作用進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)其可以通過抑制蛋白酪氨酸磷脂酶來控制胰島素的敏感度。說明GPS具有降低血糖作用。高血糖可促進(jìn)大鼠肝纖維化形成及HSC的活化［13］,GPS通過多種機(jī)制對血糖升高具有抑制作用,這可能是GPS抑制T2DM并發(fā)NAFLD大鼠肝纖維化的另一機(jī)制。

［1］李勇杰,蘇宏業(yè),李圣琦.2型糖尿病患者非酒精性脂肪肝檢出率及臨床特點(diǎn)[J].廣西醫(yī)學(xué)雜志,2012,34(1): 86-88.

［2］范慧,張鵬睿,徐援.2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝與胰島素抵抗及心血管病變發(fā)生的關(guān)系研究[J].中國全科雜志,2011,14(1B):147-150.

［3］NEUSCHWANDER-TETRI B A,CALDWELL S H.Nonalcoholic steatohepatitis:summary of an AASLD single topic Conference[J].Hepatology,2003,37(5):1202-1219.

［4］GNUDI L,THOMASSM,VIBERTIG.Mechanical forces in diabetic kidney disease:a trigger for impaired glucose metabolism[J].J AmSoc Nephrol,2007,18(8):2226-2232.

［5］CHIANG D J,PRITCHARD MT,NAGY L E.Obesity, diabetes mellitus,and liver fibrosis[J].AmJ Physiol Gastrointest Liver Physiol,2011,300(5):697-702.

［6］王戰(zhàn)建,張耀,宋慶芳,等.二甲雙胍對高糖高脂飲食誘導(dǎo)的糖尿病大鼠脂肪肝治療作用的研究[J].中國實(shí)用內(nèi)科雜志,2006,26(20):1603-1605.

［7］賀琴,雷飛飛,李儒貴,等.絞股藍(lán)皂苷降低2型糖尿病并NAFLD大鼠血糖、血脂的機(jī)制初步研究[J].湖北醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào),2013,32(1):39-43,封2.

［8］WYNN T A.Celluar and molecular mechanisms of fibrosis[J].JPathol,2008,214(2):199-210.

［9］趙迎慶,王炳元.家兔非酒精性脂肪肝肝纖維化形成中層粘連蛋白及透明質(zhì)酸的變化[J].世界華人消化雜志, 2008,16(8):823-828.

［10］張娟,路金才.皂苷的提取方法及含量測定研究進(jìn)展[J].中國現(xiàn)代中藥雜志,2006,8(3):25-28.

［11］NORBERG A,HOA N K,LIEPINSH E,et al.A novel insulin-releasing substance,phanoside,fromthe plant Gynostemma pentaphyllum[J].J Biol Chem,2004,279 (40):41361-41367.

［12］XU JQ,SHEN Q,LIJ,et al.Dammaranes fromgynostemma pentaphyllumand synthesis of their derivatives as inhibitors of protein tyrosine phosphatase1B[J].Bioorg Med Chem, 2010,18(11):3934-3939.

［13］劉銀利,吳濤,毛美絨,等.高血糖對大鼠肝纖維化及肝星狀細(xì)胞活化的影響[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志, 2013,22(1):6-9.

DOI 10.3870/yydb.2014.02.006

Effect of Gepenoside on Hepatic Fibrosis of Rats with Type 2 Diabetes Mellitus and Nonalcoholic Fatty Liver Disease

ZHAO Shi-yin1,2,QIU Hua1,2,HE Qin1,LI De-mei1,TAN Hua-bing1
(1.Department of Infectious Disease and Liver Disease,Renmin Hospital of Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,China;2.Department of Internal Medicine,Fangχian Hongta Township Health Hospital,Fangχian 442100,China)

Objective To investigate the effect of gepenoside(GPS)on hepatic fibrosis of rats with type 2 diabetes mellitus(T2DM)and non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD).MethodsT2DMand NAFLD model(group M)and NAFLD model(group NM)were established by feeding the ratswith high-fat diet and injection of streptozotocin.The T2DMand NAFLDmodelwas administered with GPS(1 g·kg-1·d-1)(group JH)or GPS(0.5 g·kg-1·d-1)(group JL).α-SMA in the liver tissueswas determinied by quantified PCR.Blood glucose,triacylglycerol(TG),total cholesterol(TC)and hyaluronic acid were examined.Laminin(LN)expression in liver tissues was detected by immunohistocheministry.Resultsα-SMA expression in the liver tissueswas as follows:the amplification ofα-SMA in group N was regarded as1,and that in group Mwas 3.17,with significant difference(P<0.01);The amplification ofα-SMA in group NMwas 2.37(P<0.01 vs.group N);That was 2.26 in group JH(P<0.01 vs.group M);Thatwas2.63 in group JL(P<0.05 vs.group JH).LN expression levelswere as follows:greatest in group M,middle in group JL and MN,lowest in group JH.HA was significantly increased in groups M,NM, JH,and JL(P<0.01 vs.group N).There were significant differences in HA between group JH,JL and group M(P<0.01). There were significant differences in blood glucose levels,TG and TC between group JH［(10.86±3.46),(1.41±0.10)and (1.83±0.56)mmol·L-1］,group JL［(14.78±3.39),(1.49±0.20)and(2.82±0.66)mmol·L-1］and group M［(18.84±4.24),(1.85±0.12)and(3.97±0.64)mmol·L-1］(P<0.01).Significant differences in blood glucose and TG were also found between group JH and group JL(P<0.05,P<0.01).ConclusionGPS can alleviate hepatic fibrosis of rats with T2DMand NAFLD.

Gypenoside;Diabetesmellitus,type 2;Liver disease,fatty,non-alcoholic;Hepatic fibrosis

R965

A

1004-0781(2014)02-0156-04

2013-04-05

2013-05-22

*2009年湖北省衛(wèi)生廳科研項(xiàng)目(JX4B59)。

趙世印(1963-),男,湖北房縣人,副主任醫(yī)師,主要研究方向:從事中西醫(yī)結(jié)合內(nèi)科臨床工作。電話:0719-3224515。

譚華炳(1963-),湖北房縣人,男,主任醫(yī)師,教授,學(xué)士,主要研究方向:從事肝病臨床教學(xué)科研工作。電話: (0)13707287512,E-mail：renmthb@163.com。