王曉明，秦凌浩，鄭麗嫻，鄭青，譚載友

(廣東藥學(xué)院藥科學(xué)院，廣州 510006)

環(huán)糊精聚合物(cyclodextrin polymer，CDP)是基于環(huán)糊精的聚合物，這種聚合物既能保持環(huán)糊精包結(jié)、緩釋、催化和識(shí)別的能力，又兼具高聚物的特性，如良好的機(jī)械強(qiáng)度、較好的穩(wěn)定性、環(huán)境敏感性、滲透擴(kuò)散性和化學(xué)可調(diào)性等[1]。研究表明，CDP可以實(shí)現(xiàn)藥物的緩釋控釋，且其增加水難溶性藥物的溶解度、溶解速率和提高藥物生物利用度的效果明顯優(yōu)于環(huán)糊精單體[2]。隨著高分子科學(xué)的發(fā)展，環(huán)糊精聚合物已成為當(dāng)今的熱點(diǎn)研究方向之一。雙氯芬酸鈉(diclofenac sodium，DFS)為第2代非甾體解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥，具有使用劑量小、療效高、起效快、不良反應(yīng)少的特點(diǎn)[3]。但由于其在水中的溶解度很低，對(duì)胃黏膜的刺激性大，半衰期短而需頻繁給藥等缺點(diǎn)影響其廣泛使用[4]。因此，本研究以 β-環(huán)糊精聚合物(β-CDP)為載體材料，制備雙氯芬酸鈉-β-CDP緩釋微球，優(yōu)化其制備工藝，并考察其釋藥特征，旨在降低其對(duì)胃黏膜刺激、減少給藥次數(shù)，為以后進(jìn)一步制成適宜的劑型提供前期工作基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UV-1810紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海分析儀器廠)，Q600 SDT型熱分析儀(美國(guó) TAINC公司)，CS501型超級(jí)恒溫器(重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)，JJ-1型增力電動(dòng)攪拌器(江蘇省金壇市宏華儀器廠)，DZF-6020型真空干燥箱(上海迅博實(shí)業(yè)有限公司)，IX51光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS BX-50)，S-520 Scanning Electron Microscope(日本HITACHI)，氣浴恒溫振蕩器(江蘇省金壇市宏華儀器廠)，KQ-100型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 雙氯芬酸鈉對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào):10334-0001)，雙氯芬酸鈉原料藥(河南東泰制藥有限公司，批號(hào):110812，標(biāo)示量98%)，β-CD[生化試劑，中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司，批號(hào):20100812]，環(huán)氧氯丙烷(epichlorohydrin，EPI，分析純，天津福晨化學(xué)試劑廠，批號(hào):20110302)，無(wú)煙煤油(天津億茂化工集團(tuán)，批號(hào):20120608)，司盤80(化學(xué)純，天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào):20110801)，聚山梨酯20(化學(xué)純，天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號(hào):20110317)等。

2 方法與結(jié)果

2.1 β-CDP空白微球的制備 根據(jù)文獻(xiàn)[5]，精密稱取β-CD12 g，加入適量40%氫氧化鈉溶液，加熱溶解。在30℃、恒速攪拌下，緩慢滴加 EPI 12.5mL，反應(yīng)1.5 h。在高速攪拌下，加入含有混合乳化劑(司盤80∶聚山梨酯20=3∶1，即司盤80為1.2 g、聚山梨酯20為0.4 g)的煤油 80 g，10 min后降低攪拌速度至800 r·min－1，升溫至50℃，繼續(xù)攪拌反應(yīng)6 h。反應(yīng)結(jié)束后，靜置30 min，傾去上層油相，將產(chǎn)品抽濾，并依次用稀鹽酸、乙醇、純化水、丙酮充分洗滌后抽干，以除去各種雜質(zhì)。置于通風(fēng)櫥內(nèi)于室溫下晾干，然后用真空干燥箱于60℃下干燥至恒重，即得β-CDP空白微球。

2.2 β-CDP載藥微球(DFS-β-CDP)的制備 取 DFS適量，溶解于無(wú)水乙醇20mL中，然后加入經(jīng)干燥的β-CDP空白微球(MS)1 g，于一定溫度下浸泡若干小時(shí)。載藥結(jié)束后，冷卻至室溫，用純化水沖洗微球表面，抽干，于60℃下真空干燥至恒重，即得載藥微球。本研究通過(guò)正交設(shè)計(jì)對(duì)藥物溶液濃度、載藥溫度、微球與藥物質(zhì)量比、載藥時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行考察，每個(gè)因素取3個(gè)水平(表1)。選擇L9(34)的正交實(shí)驗(yàn)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以載藥率(C，%)(S1)和包封率(En，%)(S2)的綜合評(píng)分指標(biāo)(S)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，根據(jù) S=0.3(S1/S1最大)+0.7(S2/S2最大)計(jì)算，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果和方差分析見(jiàn)表2和表3。表2的極差分析結(jié)果表明:4個(gè)因素對(duì)微球綜合評(píng)分指標(biāo)的影響順序是:A＞B＞C＞D，即DFS濃度＞載藥溫度＞微球與藥物質(zhì)量比＞載藥時(shí)間。從表3的方差分析可以看出，DFS濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有顯著性影響(P＜0.05)。綜合考慮載藥率與包封率，又要降低工藝成本，最終確定制備DFS-β-CDP微球的最佳工藝條件為A3B2C1D1，即DFS濃度為30%，載藥溫度45℃，微球與藥物質(zhì)量比為1∶1，載藥時(shí)間24 h。

2.3 制備工藝的驗(yàn)證 通過(guò)對(duì)上述最佳處方工藝進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，制備6批DFS-β-CDP微球，確定在該條件下制得的微球載藥率為(12.384±0.214)%、包封率為(45.372±2.121)%(n=6)，說(shuō)明所確定的最優(yōu)工藝條件穩(wěn)定，重復(fù)性好。

表1 L9(34)因素水平表Tab.1 Factors and levels of the orthogonal test

表2 正交設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Design and results of the orthogonal test

表3 綜合指標(biāo)方差分析Tab.3 Variance analysis of comprehensive index

2.4 DFS-β-CDP微球載藥率及包封率的測(cè)定 采用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定微球的載藥率及包封率。具體操作如下:精密稱取DFS-β-CDP微球50 mg，研細(xì)，置于100mL量瓶中，加入2mmol·L－1氫氧化鈉適量，超聲30 min，加2mmol·L－1氫氧化鈉溶液定容，搖勻。經(jīng)孔徑0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后用分光光度計(jì)于276nm處測(cè)定吸光度(A)。根據(jù)已測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(精密稱取DFS對(duì)照品 25 mg，置于100mL量瓶，加入2mmol·L－1氫氧化鈉溶解并定容。分別吸取1，2，3，4，5mL于50mL量瓶，加2mmol·L－1氫氧化鈉溶液定容，搖勻。用分光光度計(jì)于276nm處測(cè)定吸光度(A)。以A值對(duì)質(zhì)量濃度(ρ)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=0.0327ρ +0.0546，r=0.9997(n=6)。求得 DFS 的含量，并按照以下公式計(jì)算載藥率及包封率。載藥率(%)=微球中實(shí)際藥量/微球總量×100%;包封率(%)=微球中實(shí)際藥量/投藥量×100%。

2.5 DFS-β-CDP 微球的結(jié)構(gòu)表征

2.5.1 微球粒徑大小及表面形態(tài) 采用光學(xué)顯微鏡觀察微球的粒徑分布，平均粒徑為(99.47±3.50)μm，跨距為(1.00±0.21)μm(n=6)。使用掃描電子顯微鏡觀察微球的表面形態(tài)和分散性。結(jié)果表明，制得的DFS-β-CDP微球表面光滑而圓整，形態(tài)見(jiàn)圖1。

2.5.2 熱分析 微球中藥物和聚合物的形態(tài)以及相互作用對(duì)微球載體的性能有很大影響。藥物與聚合物的親和性不同，體現(xiàn)在二者之間存在的相互作用。本研究用美國(guó)TAINC公司的Q600 SDT型熱分析儀測(cè)定了下列樣品的熱重分析(thermogravimetry analysis，TGA)和差熱分析(differential scanning calorimetry，DSC):DFS、β-CDP 微球、DFS-β-CDP 微球，考察雙氯芬酸鈉制成微球后的熱穩(wěn)定性。具體步驟:將樣品研成細(xì)粉，稱取5～10 mg置于樣品池中。以相同的空白坩堝為內(nèi)置空白，實(shí)驗(yàn)在氮?dú)?N2)氣氛中(流速為20mL·min－1)進(jìn)行，升溫范圍20～500℃，控制升溫速率為5℃·min－1。分別測(cè)定3種樣品的TGA-DSC曲線，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，對(duì)于DFS，在276.44℃處的熔融峰表明藥物的晶體形態(tài)。β-CDP微球開始分解溫度為275℃，當(dāng)溫度高于455℃后，總失重達(dá)80.66%，之后基本不再隨溫度變化，失重可能是由聚合物中環(huán)氧氯丙烷的揮發(fā)所致;而DFS-β-CDP微球具有一個(gè)全新的熱分析圖譜，開始分解的溫度為250℃，當(dāng)溫度高于485℃后，總失重達(dá)80%，之后基本不再隨溫度變化;且整個(gè)圖中不存在雙氯芬酸鈉的熔融峰，這表明藥物以無(wú)定形的狀態(tài)分散在聚合物載體中。由此說(shuō)明，雙氯芬酸鈉制成微球后，其與β-CDP之間存在著較強(qiáng)的相互作用，并具有良好的熱穩(wěn)定性[5]。

圖1 DFS-β-CDP微球的掃描電鏡照片F(xiàn)ig.1 Scanning electron microscopy picture of DFS-β-CDP MS

2.6 體外釋放度考察

圖2 DFS(A)、β-CDP微球(B)和DFS-β-CDP微球(C)的熱重分析和差熱分析Fig.2 Gravitational thermal analysis and thermal differential analysis of DFS(A)，β-CDP microsphere(B)and DFS-β-CDP microsphere(C)

2.6.1 測(cè)定波長(zhǎng)的確定 ①對(duì)照品溶液的制備:取DFS對(duì)照品適量，置于100mL量瓶中，以少量乙醇溶解后用pH6.8磷酸緩沖液稀釋至刻度，搖勻備用。②輔料溶液的制備:取空白微球適量，加入少量乙醇，超聲30 min后經(jīng)孔徑0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液置于100mL量瓶中并用 pH6.8磷酸緩沖溶液(phosphate buffered saline，PBS)稀釋至刻度。照《中華人民共和國(guó)藥典》2010版二部附錄ⅣA分光光度法，在200～400nm波長(zhǎng)內(nèi)掃描，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，DFS在276.5nm處有最大吸收，而空白微球在此處幾乎無(wú)吸收，可見(jiàn)其對(duì)藥物的測(cè)定無(wú)干擾，故選擇276.5nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖3 β-CDP微球(A)和DFS(B)的紫外掃描圖譜Fig.3 UV scanning spectrum of β-CDP microsphere(A)and DFS(B)

2.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取對(duì)照品適量，用pH6.8PBS配制成一系列不同濃度的對(duì)照品溶液。在276.5nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)，以A值對(duì)質(zhì)量濃度(ρ)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:A=0.032ρ +0.0102，r=0.9999，(n=6)。結(jié)果表明，DFS在5 ～25 mg·L－1的濃度范圍內(nèi)，吸光度與質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好。

2.6.3 精密度考察 分別配制低、中、高3種濃度的對(duì)照品溶液，測(cè)定A值，按照回歸方程計(jì)算實(shí)測(cè)濃度，考察方法的日內(nèi)變異和3 d的日間變異，日內(nèi)RSD值分別為 0.78%，0.57%，0.43%，日間 RSD 值分別為0.66%，0.27%，0.21%(n=6)。結(jié)果表明方法的精密度良好。

2.6.4 穩(wěn)定性考察 取對(duì)照品溶液及供試品溶液，分別于0，1，2，4，8 h 進(jìn)行 A 值測(cè)定，考察樣品的穩(wěn)定性。結(jié)果在8 h內(nèi)對(duì)照品溶液與供試品溶液A值的RSD值分別為0.40%，1.23%(n=6)。結(jié)果表明樣品溶液在8 h內(nèi)測(cè)定穩(wěn)定性良好。

2.6.5 回收率測(cè)定 精密稱取干燥至恒重的DFS 20，25，30 mg，置于100mL 量瓶中，加 pH6.8PBS 適量使完全溶解，再分別加入粉碎后的空白微球 60，75，90 mg，超聲30 min后經(jīng)孔徑0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液稀釋至適當(dāng)濃度后，于276.5nm波長(zhǎng)處測(cè)定A值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品的回收率。結(jié)果表明方法的平均回收率為98.74%，RSD=0.52%(n=6)。

2.6.6 釋放度的測(cè)定 精密稱取載藥微球適量，置于透析袋中，加入釋放介質(zhì)2mL，扎緊透析袋，懸浮于具塞玻璃瓶中。透析袋外加入pH6.8 PBS 98mL。置于氣浴恒溫振蕩器中，溫度保持(37±1)℃振蕩，定時(shí)取出釋放介質(zhì)5mL，同時(shí)補(bǔ)充同體積介質(zhì)。釋放液經(jīng)孔徑0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，在276.5nm 波長(zhǎng)處測(cè)定 A值，計(jì)算藥物累積釋放百分率。

2.6.6.1 不同載藥量對(duì)微球體外釋放的影響 圖4為不同含藥量下DFS-β-CD微球的釋放曲線。由圖4可見(jiàn)，隨著藥物含量的增加，釋放速率略有降低。

2.6.6.2 不同粒徑對(duì)微球體外釋放的影響 圖5為不同粒徑的DFS-β-CD微球在pH6.8PBS中的釋放曲線。從圖5中可以看到，釋放曲線隨著粒徑的增大而降低。較小粒徑的微球由于擴(kuò)散路徑較短，且擴(kuò)散時(shí)的比表面積較大，因此藥物的釋放速率較高。由此可見(jiàn)，改變粒徑大小可以作為控制藥物釋放速率的有效手段。

2.6.6.3 透析袋內(nèi)介質(zhì)的體積對(duì)微球體外釋放的影響 為考察透析袋內(nèi)釋放介質(zhì)對(duì)微球釋藥速度的影響，本研究使透析袋內(nèi)釋放介質(zhì)的體積V2分別為:2mL、7mL和8mL，而透析袋外釋放介質(zhì)的體積V1為(100－V2)mL，釋藥結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，透析袋內(nèi)釋放介質(zhì)的體積對(duì)DFS-β-CDP微球的釋藥速度有一定的影響。開始階段，3種情況相差不大;隨后，隨著透析袋內(nèi)釋放介質(zhì)體積的增大，釋放速率略有增大，這主要是因?yàn)殡S著透析袋內(nèi)溶液體積的增加，微球溶脹后袋內(nèi)溶液的黏度降低，使得藥物的溶解速率增大。同時(shí)說(shuō)明，藥物從袋內(nèi)向袋外擴(kuò)散的速率與袋內(nèi)藥物溶液的濃度無(wú)關(guān)。

2.6.6.4 不同pH值對(duì)微球體外釋放的影響 為考察不同pH值釋放介質(zhì)對(duì)微球釋藥速度的影響，本研究使透析袋內(nèi)釋放介質(zhì)的體積V2為2mL，透析袋外釋放介質(zhì)的體積V1為98mL。DFS-β-CDP微球在不同pH的PBS中的釋放曲線見(jiàn)圖7。結(jié)果表明，溶液的pH對(duì)藥物的釋放速率影響很大，釋放速率隨著pH的增大而加快，這是由于雙氯芬酸鈉的溶解度隨pH的增大而增大的緣故。

2.6.7 藥物釋放的模型擬合 反復(fù)測(cè)定最佳工藝條件下制得的DFS-β-CDP微球在pH6.8 PBS中的釋放曲線，結(jié)果見(jiàn)圖8。如圖所示，最佳工藝條件下制得的DFS-β-CDP微球無(wú)明顯的突釋現(xiàn)象，到24 h藥物才基本釋放完全。以零級(jí)、一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程、Higuchi方程進(jìn)行擬合，結(jié)果表明藥物釋放行為符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程 ln( 1 －Q)= －0.0716 －0.0822t(r=0.9927)。這說(shuō)明，DFS經(jīng)聚合物微球的包載后具有明顯的緩釋效果，原因在于它能與β-CDP微球的網(wǎng)狀孔隙及β-CD的空腔充分地嵌合，主客體之間的結(jié)合力較強(qiáng)。此外，圖9為微球釋藥前后的掃描電鏡圖片。由圖可見(jiàn)，釋藥后微球表面粗糙、疏松多孔，可見(jiàn)，這些孔道的存在是藥物擴(kuò)散的主要通道。釋放后的微球形狀仍然保持完整的球形，因此可以判斷，當(dāng)以pH6.8 PBS為釋放介質(zhì)時(shí)，β-CDP微球未發(fā)生溶蝕、降解等。

圖8 DFS-β-CDP微球的累積釋放曲線(n=6)Fig.8 Cumulative release curve of DFS-β-CDP MS(n=6)

圖9 DFS-β-CDP微球釋放前后的掃描電鏡照片A.釋放前;B.釋放后Fig.9 SEM picture of DFS-β-CDP before release and after releaseA.before release;B.after release

3 討論

本研究以β-CD為原料、EPI為交聯(lián)劑、并以水相作為分散相、有機(jī)相煤油作為連續(xù)相、司盤80和聚山梨酯20為乳化劑，在強(qiáng)堿性條件下，采取反相聚合技術(shù)制備藥物控制釋放載體β-CDP微球。該技術(shù)具有聚合速率高、聚合物分子量高、得到的乳膠通過(guò)調(diào)節(jié)體系的pH或加入適當(dāng)乳化劑的方法能使聚合物迅速地溶于水等優(yōu)點(diǎn)。

本研究通過(guò)正交設(shè)計(jì)，確定制備DFS-β-CDP緩釋微球的最佳工藝條件為:DFS濃度30%，載藥溫度45℃，微球與藥物質(zhì)量比為1∶1，載藥時(shí)間24 h。微球的體外釋放可以很好地用緩釋模型進(jìn)行擬合。

體外釋放影響因素考察結(jié)果表明，不同的pH、袋內(nèi)釋放介質(zhì)體積、載藥率和粒徑對(duì)藥物的釋放有明顯影響，其中粒徑的影響最大。事實(shí)上，影響微球釋放速率的其他因素很多，包括微球的致密性、藥物在微球中的分散水平、組分間的親和作用等，它們對(duì)藥物的溶出和擴(kuò)散都有影響，微球性質(zhì)的變化是這些因素的綜合結(jié)果。

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