盛燕，陳浩，張文婷

(浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，杭州 310004)

百合固金片由百合、地黃、熟地黃、麥冬、玄參、川貝母、當(dāng)歸、白芍、桔梗、甘草等10味中藥組成，具有養(yǎng)陰潤(rùn)肺、化痰止咳的功效，用于肺腎陰虛、干咳少痰、咽干喉痛[1]。有本品批準(zhǔn)文號(hào)的企業(yè)共2家，包裝規(guī)格2種，分別執(zhí)行國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)YBZ08222005-2009Z和YBZ13272009，檢測(cè)方法不同，不能有效判別制劑的質(zhì)量?jī)?yōu)劣。根據(jù)國家藥典委員會(huì)關(guān)于2010～2011年度國家藥品標(biāo)準(zhǔn)提高任務(wù)，筆者參考文獻(xiàn)[2-4]，統(tǒng)一當(dāng)歸、玄參、白芍、甘草的薄層色譜(thin-layer chromatography，TLC)鑒別方法。芍藥苷具抗炎、擴(kuò)張血管、抗驚厥、免疫調(diào)節(jié)等作用[5-6]，建立高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法對(duì)芍藥苷進(jìn)行定量測(cè)定。結(jié)果表明，提高后的標(biāo)準(zhǔn)可操作性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可統(tǒng)一作為2個(gè)廠家百合固金片的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津(Shimadzu LC-20ADXR)系列液相色譜儀、安捷倫(Agilent 1100)系列液相色譜儀、戴安(Dionex U3000RS LC)系列液相色譜儀、CAMAG Reprostar 3數(shù)碼成像系統(tǒng)(瑞士卡瑪公司)。

1.2 試藥 當(dāng)歸對(duì)照藥材(批號(hào):120927-200613)、哈巴俄苷對(duì)照品(批號(hào):111730-200603)、甘草苷對(duì)照品(批號(hào):111610-200604)和芍藥苷對(duì)照品(批號(hào):110736-200934，供含量測(cè)定用，含量以95.7%計(jì))，均由中國食品藥品檢定研究院提供。硅膠G薄層板由青島海洋、煙臺(tái)、Merck公司提供。百合固金片由××××制藥有限公司、××××藥業(yè)有限公司提供;陰性樣品由××××制藥有限公司提供。乙腈為色譜純，水為重蒸水，其余為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 當(dāng)歸的鑒別 取本品20片(小片規(guī)格:每片0.4 g)或15 片(大片規(guī)格:每片0.45 g)，除去包衣，研細(xì)，加環(huán)己烷50mL，超聲處理30 min，濾過，藥渣備用，濾液蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴?mL使溶解，作為供試品溶液。另取當(dāng)歸對(duì)照藥材0.5 g，加環(huán)己烷20mL，同法制成對(duì)照藥材溶液。取缺當(dāng)歸陰性樣品8 g，同法制成陰性樣品溶液。照TLC法(《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B)實(shí)驗(yàn)，吸取上述溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯(9∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。6批樣品均具當(dāng)歸對(duì)照藥材的特征斑點(diǎn)，陰性樣品無干擾，見圖1。

圖1 當(dāng)歸TLC圖譜1.缺當(dāng)歸樣品;2～7.供試品;8.當(dāng)歸對(duì)照藥材Fig.1 TLC chromatogram of Angelicae sinensis Radix1.negative sample without Angelicae sinensis Radix;2-7.samples;8.reference herb of Angelicae sinensis Radix

2.2 玄參的鑒別 取當(dāng)歸薄層鑒別項(xiàng)下的藥渣，揮干環(huán)己烷，加甲醇50mL，加熱回流30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀m量使溶解，通過D101型大孔吸附樹脂柱(內(nèi)徑為1 cm，柱高為15 cm)，先用水洗至洗脫液無色，再用15%乙醇50mL洗脫，棄去洗脫液，繼用30%乙醇50mL洗脫，收集洗脫液，蒸干備用，再用乙醇50mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)铀?0mL使溶解，加濃氨試液1mL，搖勻，用水飽和的正丁醇60mL振搖提取，正丁醇提取液用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次30mL，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。取缺玄參陰性樣品8 g，同法制成陰性樣品溶液。另取哈巴俄苷對(duì)照品，加甲醇制成每毫升含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照TLC法(《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B)實(shí)驗(yàn)，吸取上述溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(12∶4∶1)的下層溶液為展開劑，預(yù)飽和15 min，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液(臨用新配)，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)顯色清晰。6批樣品均具哈巴俄苷對(duì)照品的特征斑點(diǎn)，陰性樣品無干擾，見圖2。

2.3 白芍、甘草的鑒別 取玄參薄層鑒別項(xiàng)下30%乙醇洗脫液蒸干的殘?jiān)?，加甲?mL使溶解，作為供試品溶液。分別取缺白芍、缺甘草陰性樣品8 g，同法制成陰性樣品溶液。另取芍藥苷和甘草苷對(duì)照品，分別加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照TLC法(《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄ⅥB)實(shí)驗(yàn)，吸取上述溶液各2μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水(12∶4∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)顯色清晰。6批樣品均具甘草苷和芍藥苷對(duì)照品的特征斑點(diǎn)，陰性樣品無干擾，見圖3。

圖2 哈巴俄苷TLC圖譜1.缺玄參樣品;2.哈巴俄苷對(duì)照品;3～8.供試品Fig.2 TLC chromatogram of Harpagoside1.negative sample without Scrophulariae Radix;2.reference substance of Harpagoside;3 －8.samples

圖3 甘草苷和芍藥苷TLC圖譜1.缺甘草樣品;2.缺白芍樣品;3.甘草苷;4.芍藥苷;5～10.供試品Fig.3 TLC chromatogram of Liquiritin and Paeoniflorin1.negative sample without Glycyrrhizae Radix et Rhizoma;2.negative sample without Paeoniae Radix alba;3.reference substance of Liquiritin;4.reference substance of Paeoniflorin;5 －10.samples

2.4 芍藥苷的定量測(cè)定

2.4.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 色譜柱為Agilent SB C18(250 mm × 4.6 mm，5μm)，柱溫為30℃，流動(dòng)相為乙腈-0.05%三乙胺溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH 至2.5)(14∶86)，流速為 1.0mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm，進(jìn)樣量為10μL。理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)應(yīng)不低于4000。芍藥苷與樣品中其他組分分離良好;缺白芍陰性對(duì)照無干擾。色譜圖見圖4。

圖4 陰性樣品(A)、芍藥苷對(duì)照品(B)和樣品(C)HPLC色譜圖1.芍藥苷Fig.4 HPLC chromatograms of negative sample without Paeoniae Radix alba(A)，reference substance of Paeoniflorin(B)and sample(C)1.paeoniflorin

2.4.2 溶液的制備

2.4.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱定，加稀乙醇制成每毫升含40μg的溶液，即得。

2.4.2.2 供試品溶液的制備 取本品20片，精密稱定，研細(xì)，小片取約1 g，大片取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 取缺白芍陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備。

2.4.3 線性關(guān)系考察 精密吸取芍藥苷對(duì)照品溶液(15.01μg·mL－1)1，3，5，10，20μL 和芍藥苷對(duì)照品溶液(150.10μg·mL－1)5，10，16，20，25μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量(ng)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得線性回歸方程為Y=1236.1X+6746.8，r=0.9999(n=10)，結(jié)果表明，芍藥苷在進(jìn)樣量15.01 ～3752.50 ng范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.4.4 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按上述色譜條件測(cè)定芍藥苷峰面積，結(jié)果峰面積平均值為3118772，RSD為0.09%，表明儀器精密度良好。

2.4.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一供試品6份，照供試品溶液制備方法制備，按上述色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定，計(jì)算，結(jié)果芍藥苷的平均含量為 5.96 mg·g－1，RSD為1.94%，表明本法重復(fù)性良好。

2.4.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，于0，8.5，12.5，24.5，38，46 h 分別進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定芍藥苷峰面積，結(jié)果峰面積平均值為3113561，RSD為0.32%，表明供試品溶液在46 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.7 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn) 采用加樣回收法，精密稱取已知含量樣品9份，分別精密加入芍藥苷對(duì)照品適量，按供試品溶液制備方法制備，在上述色譜條件下測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果芍藥苷平均回收率為103.3%，RSD=0.93%(n=9);結(jié)果見表 1。

表1 芍藥苷加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=9)Tab.1 Result of recovery tests of paeoniflorin

2.5 樣品測(cè)定 取樣品6批，按供試品溶液制備方法制備，在上述色譜條件下測(cè)定，計(jì)算，結(jié)果每片芍藥苷含量分別為 2.24，2.61，2.79，1.00，1.05，1.04 mg。

3 討論

建立TLC方法，供試品制備時(shí)，設(shè)計(jì)系統(tǒng)提取純化方式，綜合利用樣品，簡(jiǎn)化操作步驟。比較不同的展開劑:當(dāng)歸鑒別采用環(huán)己烷-乙酸乙酯(9∶1)和正己烷-乙酸乙酯(4∶1)為展開劑，玄參鑒別采用三氯甲烷-甲醇-水(12∶4∶1)的下層溶液和乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水(12∶4∶1∶1)為展開劑，白芍和甘草鑒別采用乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水(12∶4∶1∶1)和三氯甲烷-甲醇-水(12∶4∶1)的下層溶液為展開劑，均達(dá)到理想效果。比較不同廠家的硅膠G板:青島海洋、煙臺(tái)、Merck等均達(dá)到理想效果。比較不同的濕度:玄參鑒別在高濕環(huán)境下薄層效果明顯下降，故在實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)避免高濕;當(dāng)歸、白芍、甘草鑒別均達(dá)到理想效果。

建立HPLC法測(cè)定芍藥苷，改進(jìn)色譜條件，改善芍藥苷的峰形和分離度。制備供試品溶液時(shí)，進(jìn)行提取方法(超聲和回流)，提取溶劑(70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇和甲醇)，稱樣量(0.5和1.0 g)及提取時(shí)間(20，30和40 min)的比較，最后選擇最佳的制備條件。實(shí)驗(yàn)中還考察了儀器、色譜柱、柱溫、流速、流動(dòng)相pH值及流動(dòng)相三乙胺濃度的變化對(duì)分離度等結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)在測(cè)定條件下，系統(tǒng)的輕微變化對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不大，系統(tǒng)耐用性良好。

筆者曾參考文獻(xiàn)[3-4]，采用HPLC法在同一條件對(duì)白芍中芍藥苷，甘草中甘草苷、甘草酸銨及玄參中哈巴俄苷的含量測(cè)定方法進(jìn)行研究。比較不同梯度、不同比例的乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液和乙腈-0.05%三乙胺溶液(用H3PO4調(diào)pH至2.5)等多種流動(dòng)相，比較了Agilent SB-C18、Kromasil KR100-5 C18、shim-pack VP-ODS C18、phenomenex Luna C18等不同色譜柱，結(jié)果樣品有干擾，分離度均不佳，耐用性較差，故未列入標(biāo)準(zhǔn)。

[1]YBZ08222005-2009Z，YBZ13272009，國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)[S].

[2]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:80，96，108，124.

[3]楊玲娟，趙曉莉，狄留慶，等.HPLC法測(cè)定芍藥甘草湯總有效部位中4個(gè)活性成分的含量[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2007，25(3):522 －524.

[4]劉傳統(tǒng)，祁紅.和中利膽口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[J].中國藥師，2011，14(8):1227 －1229.

[5]鄭世存，李曉宇，歐陽兵，等.芍藥苷藥理作用研究新進(jìn)展[J].中國藥物警戒，2012，9(2):100 －103.

[6]李文艷，黃山君，王端.中藥白芍的藥理作用和質(zhì)量控制研究進(jìn)展[J].藥學(xué)服務(wù)與研究，2012，12(2):118 －122.