王捷，劉偉，葉勇，何成章，陸華，程道海，黎淵弘

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)制藥廠，南寧 530021;2.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530021;3.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，南寧 530021)

龍蛭膠囊由地龍、菲牛蛭、川芎和紅花等提取物蚓激酶、菲牛蛭素、阿魏酸、紅花黃色素等組成，有抗凝和纖溶雙重作用，臨床用于防治血栓疾病[1-2]。該藥通過(guò)多成分的協(xié)同、整合，多種作用靶點(diǎn)起到防治血栓的目的。為控制質(zhì)量，現(xiàn)以纖維蛋白平板法測(cè)定纖溶活性，用全自動(dòng)血凝儀測(cè)定該藥體外抗凝效應(yīng)，用薄層色譜(thin-layer chromatography，TLC)法鑒別阿魏酸、羥基紅花黃色素A，高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法測(cè)定阿魏酸和羥基紅花黃色素A含量等，利于該藥質(zhì)量控制。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters515高效液相色譜儀(沃特世科技上海有限公司);N2000色譜數(shù)據(jù)工作站(浙江大學(xué)智能信息工程有限公司);BP211D電子天平(德國(guó)Sartorius，精密度:0.01 mg);UV-2100雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器公司);LDZ4-0.8自動(dòng)平衡微型離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠);B11241-89B電熱恒溫水浴箱(北京醫(yī)療設(shè)備廠);ACL-Advace全自動(dòng)血凝儀(美國(guó)IL公司生產(chǎn));ZF-20C暗箱式紫外分析儀(上海寶山顧村電子儀器廠);BZ500S-M7超聲器(必能信超聲上海有限公司);OLYMPUS SP-800數(shù)碼照相機(jī)。

1.2 試藥 龍蛭膠囊(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院研制，批號(hào):20100901，20101001，20101101);注射用尿激酶(廣東天普生物化學(xué)制藥有限公司，批號(hào):20110105);阿魏酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào):110773-201313，含量:99.6%);羥基紅花黃色素A對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào):111637-200503，含量:98%);甲醇:色譜純;水為雙蒸水;其他試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物 家兔，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，動(dòng)物雌雄兼用，均由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(桂)2009-0002。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀 本品為膠囊，除去囊殼后顯灰黃棕色至棕褐色粉末，味微腥，微苦。

2.2 纖溶活性檢測(cè)[3-4]

2.2.1 纖溶活性定性檢測(cè) 采用纖維蛋白平板法(標(biāo)準(zhǔn)平板和加熱平板)。按需在平板上打直徑3 mm小孔，每孔加不同濃度的尿激酶或龍蛭膠囊10μL(含龍蛭膠囊內(nèi)容物3 mg)，置37℃保溫18 h后取出觀察。結(jié)果:龍蛭膠囊在普通平板和加熱平板上都能溶解纖維蛋白(溶圈直徑20 mm)，而尿激酶在普通平板上有較強(qiáng)的纖溶作用，在加熱平板上則無(wú)纖溶作用(無(wú)溶圈)，也說(shuō)明龍蛭膠囊纖溶機(jī)制與尿激酶不同，是以直接纖溶為主。

2.2.2 纖溶活性定量檢測(cè) 配制 1000，500，250，125，62.5，31.25 U·mL－16個(gè)濃度的尿激酶標(biāo)準(zhǔn)系列，37℃保溫18 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量最大和最小直徑，以標(biāo)準(zhǔn)品兩直徑乘積對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品活力單位雙對(duì)數(shù)作圖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以樣品乘積查標(biāo)準(zhǔn)曲線得活力單位。Y=0.348X+0.552，r=0.951。結(jié)果龍蛭膠囊纖溶活性為73 U·g－1。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，用方差分析q檢驗(yàn)，t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 抗凝效應(yīng)

2.3.1 貧血小板血漿的制備 家兔由頸動(dòng)脈抽血，用3.8%枸櫞酸鈉抗凝，血液與抗凝劑之比為9∶1，4000 r·min－1離心 15 min，(離心機(jī)半徑 r=12 cm)取上清液即為貧血小板血漿。

2.3.2 體外法 取龍蛭膠囊600 mg溶于0.9%氯化鈉溶液至 2.5mL，以 4000 r·min－1離心 10 min，得上清液 1.75mL(約342 g·L－1生藥)，分別取上清液 1，0.5，0.25mL(對(duì)照組給予 0.9%氯化鈉溶液)，分別加入用由上述所制備的貧血小板血漿9，9.5，9.75mL3個(gè)不同稀釋濃度，每一稀釋濃度取100μL，然后按活化部分凝血酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time，APTT)、凝血酶原時(shí)間(prothrombin time，PT)、凝血酶時(shí)間(thrombin time，TT)試劑盒說(shuō)明，在美國(guó)IL公司ACL-Advace全自動(dòng)血凝儀上進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果龍蛭膠囊體內(nèi)外APTT、PT、TT顯著延長(zhǎng)(P＜0.01)。見(jiàn)表1。

2.4 TLC 鑒別

2.4.1 阿魏酸薄層鑒別 取本品內(nèi)容物細(xì)粉1 g，加稀鹽酸30mL，超聲處理10 min，濾過(guò)，濾液用乙醚(40mL，20mL)提取2次，合并乙醚液，揮干，殘?jiān)右宜嵋阴?.5mL使溶解，作為供試品溶液。另取阿魏酸對(duì)照品適量，加乙酸乙酯制成每毫升含阿魏酸0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。另稱取陰性樣品(缺川芎提取物)1 g，同法處理，得陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB)實(shí)驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90℃)-三氯甲烷-冰醋酸(12∶4∶1)為展開(kāi)劑，10℃以下展開(kāi)，取出，晾干，于熒光燈(365nm)下觀察。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯1個(gè)相同顏色明亮熒光斑點(diǎn)。陰性對(duì)照溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上，無(wú)熒光斑點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

2.4.2 紅花黃色素薄層鑒別 取本品內(nèi)容物2 g，加80%甲醇溶液30mL，密塞，超聲處理30 min，濾過(guò)，蒸干，殘?jiān)颖?mL使溶解，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。另取羥基紅花黃色素A對(duì)照品適量，加丙酮制成每毫升含羥基紅花黃色素A0.2 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。另稱取陰性樣品(缺紅花提取物)2 g，同法處理，得陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB)實(shí)驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠H薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(7∶2∶3∶0.4)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，日光下觀察。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯1個(gè)相同顏色斑點(diǎn)。陰性對(duì)照溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上，無(wú)斑點(diǎn)，見(jiàn)圖2。

表1 4組家兔APTT、PT、TT的檢測(cè)值Tab.1 Result of APTT，PT，TT of four groups of rabbits t·s－1，

表1 4組家兔APTT、PT、TT的檢測(cè)值Tab.1 Result of APTT，PT，TT of four groups of rabbits t·s－1，

與對(duì)照組比較，*1 P＜0.01Compared with control group，*1 P ＜0.01

組別 家兔/只 濃度/(g·L－1)APTT PT TT龍蛭膠囊大劑量組 10 34.2 188.20 ±57.12*1 21.20 ±1.03*1 19.00 ±0.66*1中劑量組 10 17.1 134.20 ±13.19*1 13.50 ±0.70*1 17.12 ±0.64*1小劑量組 10 8.5 106.10 ±48.8*1 10.90 ±0.56*1 6.80 ±0.63*1對(duì)照組 10 …55.00 ±4.13 9.40 ±0.84 13.00 ±1.00

圖1 龍蛭膠囊中阿魏酸TLC圖1～3.供試品;4.陰性對(duì)照品;5.阿魏酸對(duì)照品Fig.1 TLC of ferulic acid in longzhi capsule1 －3.sample;4.negative control;5.ferulic acid reference

2.5 HPLC法測(cè)定阿魏酸含量

2.5.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性 采用 Kromasil C18(4.6 mm ×200 mm，5μm)色譜柱，流動(dòng)相:水-冰醋酸-甲醇(65∶1∶35)，流速:1.0mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng):320nm，柱溫:25℃，進(jìn)樣量:10μL，理論板數(shù)按阿魏酸峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。在上述色譜條件下測(cè)定，結(jié)果阿魏酸保留時(shí)間為14.2 min，陰性樣品對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，見(jiàn)圖3。

2.5.2 阿魏酸對(duì)照品溶液 精密稱取阿魏酸對(duì)照品16.67 mg，置50mL棕色量瓶中，加甲醇溶解后定容，搖勻，即得貯備液。精密量取貯備液1.5mL，置25mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻即得濃度為20μg·mL－1的阿魏酸對(duì)照品溶液。

2.5.3 供試品溶液制備 取龍蛭膠囊內(nèi)容物細(xì)粉約2.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入乙酸乙酯100mL，超聲處理(功率100 W，頻率40 kHz)30 min，冷卻補(bǔ)足減失質(zhì)量，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液5mL，蒸干，殘?jiān)舆m量甲醇溶解，后轉(zhuǎn)置10mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，即得。

圖2 龍蛭膠囊中紅花黃色素TLC圖1～3.供試品;4.陰性對(duì)照品;5.羥基紅花黃色素A對(duì)照品Fig.2 TLC of hydroxysafflor yellow A in longzhi capsule1 － 3.sample;4.negative control;5.hydroxysafflor yellow A reference

圖3 阿魏酸的HPLC色譜圖A.陰性對(duì)照品;B.阿魏酸對(duì)照品;C.供試品;1.阿魏酸Fig.3 HPLC chromatogram of ferulic acidA.negative control;B.ferulic acid reference;C.sample;1.ferulic acid

2.5.4 陰性對(duì)照溶液制備 按處方比例，取除川芎提取物外其他藥，制得陰性樣品，按“2.5.3”項(xiàng)制備即得。

2.5.5 線性關(guān)系考察 精密吸取阿魏酸對(duì)照品溶液2，5，10，15，20μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件依次測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程:Y=9.90×106X－7.05 ×104，r=0.9999。結(jié)果表明阿魏酸在進(jìn)樣量0.04 ～0.40μg 范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.5.6 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同濃度阿魏酸對(duì)照品溶液，按上述色譜條件，進(jìn)樣10μL，平行測(cè)定6次，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD為1.06%(n=6)，結(jié)果可見(jiàn)精密度良好。

2.5.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，間隔不同時(shí)間測(cè)定，在 0，2，4，6，8 h 各進(jìn)樣 10μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量，RSD為1.7%，結(jié)果表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取同批龍蛭膠囊內(nèi)容物6 份，按“2.5.3”項(xiàng)制備供試品溶液，分別進(jìn)樣 10μL，按上述色譜條件測(cè)定阿魏酸峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果RSD 為1.28%(n=6)。

2.5.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取同批龍蛭膠囊內(nèi)容物(阿魏酸含量0.2006%)1.25 g，置具塞錐形瓶中，精密添加阿魏酸對(duì)照品溶液(0.3334 mg·mL－1)7.5mL，平行實(shí)驗(yàn)6份，測(cè)定相應(yīng)峰面積，計(jì)算含量和回收率，結(jié)果阿魏酸平均加樣回收率為99.32%，RSD為 1.20%，見(jiàn)表 2。

表2 阿魏酸加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of recovery test of ferulic acid

2.5.10 樣品含量測(cè)定 取龍蛭膠囊3批，分別按“2.5.3”項(xiàng)制備供試品溶液，精密吸取阿魏酸對(duì)照品溶液和供試品溶液各10μL，注入色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算阿魏酸含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 3批龍蛭膠囊中阿魏酸含量測(cè)定結(jié)果Tab.3 Results of determination of ferulic acid content of longzhi capsules (n=3)

2.6 HPLC法測(cè)定羥基紅花黃色素A含量

2.6.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性 采用 Kromasil C18(4.6 mm ×200 mm，5μm)色譜柱，流動(dòng)相:甲醇-乙腈-0.8%磷酸(25∶2∶73)，流速:1.0mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng):403nm，柱溫:25 ℃，進(jìn)樣量:10μL，理論板數(shù)按羥基紅花黃色素A峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。在上述色譜條件下測(cè)定，結(jié)果羥基紅花黃色素A保留時(shí)間為38.6 min，陰性樣品對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，見(jiàn)圖4。

2.6.2 羥基紅花黃色素A對(duì)照品溶液 精密稱取羥基紅花黃色素A對(duì)照品12.5 mg，置25mL棕色量瓶中，加甲醇溶解后定容至刻度，搖勻，即得貯備液。精密量取貯備液5mL，置10mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻即得濃度為(250μg·mL－1)羥基紅花黃色素A對(duì)照品溶液。

2.6.3 供試品溶液制備 取龍蛭膠囊內(nèi)容物細(xì)粉約2.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇溶液50mL，超聲處理(功率100 W，頻率40 kHz)30 min，冷卻補(bǔ)足減失質(zhì)量，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液25mL，濃縮至約5mL，轉(zhuǎn)移至10mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，即得。

圖4 羥基紅花黃色素A的HPLC色譜圖A.陰性對(duì)照品;B.羥基紅花黃色素A對(duì)照品;C.供試品;1.羥基紅花黃色素AFig.4 HPLC chromatogram of hydroxysafflor yellow AA.negative control;B.hydroxysafflor yellow A reference;C.sample;1.hydroxysafflor yellow A

2.6.4 陰性對(duì)照溶液制備 按處方比例，取除紅花提取物外其他藥，制得陰性樣品，按“2.6.3”項(xiàng)制備即得。

2.6.5 線性關(guān)系考察 精密吸取羥基紅花黃色素A對(duì)照品溶液 2，5，10，15，20μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件依次測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程:Y=4.67 ×105X+3.18 ×105，r=0.9998。結(jié)果表明羥基紅花黃色素A在進(jìn)樣量0.5～5.0μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.6.6 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同濃度羥基紅花黃色素A對(duì)照品溶液，按上述色譜條件，進(jìn)樣10μL，平行測(cè)定6次，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD為1.32%(n=6)，結(jié)果可見(jiàn)精密度良好。

2.6.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，間隔不同時(shí)間測(cè)定，在 0，2，4，6，8 h 各進(jìn)樣 10μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD為1.73%。結(jié)果表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取同批龍蛭膠囊內(nèi)容物6 份，按“2.6.3”項(xiàng)制備供試品溶液，分別進(jìn)樣 10μL，按上述色譜條件測(cè)定羥基紅花黃色素A峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果RSD為1.47%(n=6)。

2.6.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取同批龍蛭膠囊內(nèi)容物(羥基紅花黃色素A含量0.125%)2.5 g，置具塞錐形瓶中，精密添加羥基紅花黃色素A對(duì)照品溶液(0.5 mg·mL－1)6.5mL，平行實(shí)驗(yàn) 6 份，測(cè)定相應(yīng)峰面積，計(jì)算含量和回收率，結(jié)果羥基紅花黃色素A平均加樣回收率為99.14%，RSD為1.30%，見(jiàn)表4。

表4 羥基紅花黃色素A加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Determination results of ferulic acid content in three batches of longzhi capsules

2.6.10 樣品含量測(cè)定 取龍蛭膠囊3批，分別按“2.6.3”項(xiàng)制備供試品溶液，精密吸取羥基紅花黃色素A對(duì)照品溶液和供試品溶液各10μL，注入色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算羥基紅花黃色素A含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 3批龍蛭膠囊中羥基紅花黃色素A含量測(cè)定結(jié)果Tab.5 Determination results of hydroxysafflor yellow A content in three batches of longzhi capsules

3 討論

血栓可引起血管狹窄、血液流通阻塞、部分器官缺血或栓塞，引發(fā)包括肺栓塞、急性心肌梗死、腦血栓和末梢動(dòng)靜脈血栓等疾病。心腦血管疾病已是世界上影響人類健康的最嚴(yán)重的疾病之一。治療血栓藥物分為抗血小板聚集藥、抗凝血藥和溶栓藥三類，溶栓藥物治療是目前最有效的抗血栓治療方法，但常出現(xiàn)免疫反應(yīng)、出血等副作用，故研究和控制溶栓新藥龍蛭膠囊質(zhì)量將利于該藥質(zhì)量和療效安全穩(wěn)定，利于充分發(fā)揮該藥療效特色，也符合近年來(lái)國(guó)內(nèi)醫(yī)院制劑質(zhì)量不斷提升的趨勢(shì)和定性定量要求[5-6]。

纖維蛋白平板法是目前國(guó)內(nèi)外檢測(cè)纖溶酶活性主要方法之一，有直接性、直觀性等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于納豆激酶、蚓激酶、源于各種蛇毒纖溶酶活性及自然界其它新型纖溶酶篩選方法的鑒定和活力測(cè)定[7-9]，故選用。普通纖維蛋白平板可檢出纖溶酶活性和激酶活性，現(xiàn)用加熱平板分辨這兩種活性，將制備好的平板80℃加熱30 min，檢測(cè)可直接溶解纖維蛋白的纖溶酶活性，效果良好。

阿魏酸是該藥的主要有效成分之一，可抑制血小板聚集、抗血栓形成、解除血管平滑肌痙攣、改善心肌缺血、抗炎止痛、抗氧化、提高膜穩(wěn)定性、調(diào)節(jié)人體免疫功能等，占生藥含量0.1% ～0.2%，是川芎根、莖中的一種芳香酸成分，溶于熱水，乙醇和乙酸乙酯，稍溶于乙醚，難溶于苯和石油醚。用乙酸乙酯提取時(shí)，淀粉和糖類物質(zhì)不會(huì)被提取[10－11]，測(cè)定干擾少，故選用乙酸乙酯提取法。

該藥所含的紅花黃色素是中藥菊科植物紅花(Carthamus tinctorius L.)的干燥管狀花的主要有效組分之一，由多種水溶性查爾酮成分的混合物組成，存在于紅花的水溶性提取部位，其中羥基紅花黃色素A含量最高，是紅花主要效應(yīng)物質(zhì)，有抗腦缺血損傷、抗氧化、抗心肌損傷、對(duì)血小板的活性影響、抗凝、抗腫瘤等作用[12－14]，現(xiàn)采用TLC法對(duì)該藥中此成分加以鑒別，研究結(jié)果顯示色譜效果好，相應(yīng)斑點(diǎn)清晰。

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