李璠璠，李杰，王嘉陵，肖軍花

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，武漢 430030)

地西泮對(duì)體外大鼠心肌生理特性和動(dòng)作電位的影響*

李璠璠，李杰，王嘉陵，肖軍花

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，武漢 430030)

目的研究地西泮對(duì)體外大鼠心肌生理特性和動(dòng)作電位的影響。方法采用常規(guī)體外器官實(shí)驗(yàn)法記錄右心房自搏頻率、心肌收縮力、功能性不應(yīng)期和興奮性;標(biāo)準(zhǔn)玻璃微電極細(xì)胞內(nèi)記錄技術(shù)記錄心室乳頭肌細(xì)胞動(dòng)作電位。結(jié)果0.017 5～5.25μmol·L-1地西泮對(duì)右心房自搏頻率影響不明顯,17.5～175.0μmol·L-1可濃度依賴性地降低自搏頻率,可致部分標(biāo)本停搏;地西泮低濃度時(shí)降低體外心肌收縮力,高濃度時(shí)心肌收縮力恢復(fù)甚至增強(qiáng);0.175μmol·L-1地西泮可延長左心房功能性不應(yīng)期;17.5μmol·L-1地西泮可使左心房興奮性曲線右移;17.5μmol·L-1地西泮不影響靜息電位、動(dòng)作電位時(shí)程,可明顯降低動(dòng)作電位振幅。結(jié)論地西泮直接影響心肌自搏頻率、收縮力、功能性不應(yīng)期和興奮性等特性及動(dòng)作電位振幅。

地西泮；心肌；生理特性；動(dòng)作電位

地西泮作為苯二氮 類鎮(zhèn)靜催眠藥的典型代表藥,在世界范圍內(nèi)被廣泛應(yīng)用,其有效性及安全性被大眾接受。在臨床上,很多心血管疾病如心肌缺血、心律失常、高血壓等,常聯(lián)合應(yīng)用地西泮治療,療效確切［1-4］。其機(jī)制通常認(rèn)為是通過其抗焦慮等中樞作用發(fā)揮輔助治療功效。然而,近年來有研究表明,地西泮還具有明顯的心血管作用,如抗大鼠缺血性心律失常［5］等,但地西泮對(duì)體外心肌生理特性作用筆者尚未見報(bào)道。因此,筆者在本研究系統(tǒng)研究地西泮對(duì)體外大鼠心肌自律性、收縮性、興奮性、功能不應(yīng)期及乳頭肌動(dòng)作電位的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與藥品 成年健康SD大鼠,體質(zhì)量(250± 25)g,雌雄不拘,清潔級(jí),由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào)為SCXK(鄂)20100010。地西泮購自天津金耀氨基酸有限公司,批號(hào):1105081。其他常用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 體外心肌生理特性 取大鼠,擊頭致昏,開胸,迅速取出心臟,制備帶有竇房結(jié)的右心房及左心房標(biāo)本,分別懸吊于盛有K-H液(氯化鈉6.92 g·L-1,氯化鉀0. 35 g·L-1,氯化鈣0.28 g·L-1,磷酸二氫鉀0.16 g·L-1,七水硫酸鎂0.29 g·L-1,碳酸氫鈉2.1 g·L-1,葡萄糖2.0 g·L-1,pH 7.3～7.4)的器官浴槽內(nèi),溫度(36.0±0.5)℃,連續(xù)通入95%氧氣(O2)和5%二氧化碳(CO2)混合氣體,心房標(biāo)本的靜息張力調(diào)整到1 g,平衡1～1.5 h,測以下4種心肌生理特性。

1.2.1 右心房自搏頻率 收縮信號(hào)經(jīng)肌張力換能器輸入RM6240多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠),記錄給藥前右心房自搏頻率,每隔10 min按半對(duì)數(shù)摩爾濃度累積方式給予地西泮至浴槽內(nèi),觀察其對(duì)右心房自搏頻率的影響。

1.2.2 左右心房肌收縮力 給予波寬2 ms、頻率2 Hz、比閾電壓高0.5倍的方波連續(xù)刺激標(biāo)本,引發(fā)收縮,記錄正常收縮力,每隔10 min按半對(duì)數(shù)摩爾濃度累積方式給予地西泮至浴槽內(nèi),觀察其對(duì)心肌收縮力的影響。

1.2.3 左心房肌功能性不應(yīng)期(functional refractory period,FRP)給予波寬2 ms、頻率2 Hz、5倍于閾電壓、波幅相等的兩次超強(qiáng)刺激,記錄兩脈沖均可引起收縮的最小間隔時(shí)間,即FRP,每隔10 min依次給予0.175,1.75,17.5μmol·L-1地西泮至浴槽內(nèi),觀察其對(duì)FRP的影響。

1.2.4 左心房肌興奮性 用頻率1 Hz,波寬分別為0.2,0.5,1,3,5,10 ms的方波刺激左心房,測定心肌剛好出現(xiàn)收縮時(shí)的刺激電壓強(qiáng)度,即閾電位,每隔10 min依次加入0.175,1.75,17.5μmol·L-1地西泮至浴槽內(nèi),觀察其對(duì)心肌興奮性的影響。

1.3 心室乳頭肌動(dòng)作電位 擊大鼠頭致昏迷,迅速開胸取出心臟,置入預(yù)先經(jīng)95%O2和5%CO2混合氣飽和的溫K-H液中,制備乳頭肌標(biāo)本,水平固定于恒溫浴槽內(nèi),溫度(36.0±0.5)℃,連續(xù)通入95%O2和5% CO2混合氣體,K-H液循環(huán)灌流標(biāo)本。乳頭肌由計(jì)算機(jī)直接輸出頻率1 Hz,波寬3 ms,1.5倍閾電壓刺激,用標(biāo)準(zhǔn)玻璃微電極技術(shù)引出心肌細(xì)胞動(dòng)作電位,經(jīng)微電極放大器(SWF-2W,成都儀器廠)放大,信號(hào)輸入計(jì)算機(jī)實(shí)時(shí)記錄快反應(yīng)動(dòng)作電位。待引出的動(dòng)作電位穩(wěn)定30 min后,每隔10 min依次加入0.175,1.75, 17.5μmol·L-1地西泮至浴槽內(nèi),觀察給藥前后動(dòng)作電位的變化。

2 結(jié)果

2.1 地西泮對(duì)右心房自搏頻率的作用 當(dāng)?shù)匚縻鷿舛冗_(dá)17.5,52.5,87.5和175.0μmol·L-1時(shí),可使部分右心房驟然停搏,累積停搏率分別為5.56% (1/18),16.67%(3/18),27.78%(5/18)和77.78% (14/18)。統(tǒng)計(jì)分析未停搏的11只右心房自搏頻率結(jié)果見圖1,地西泮終濃度為0.017 5,0.052 5,0.175, 0.525,1.75,5.25μmol·L-1時(shí),對(duì)體外大鼠右心房自搏頻率無明顯影響；高濃度地西泮可明顯降低右心房自搏頻率,并呈現(xiàn)濃度依賴性。

圖1 地西泮作用后對(duì)大鼠體外右心房自搏頻率影響與0μmol·L-1比較,*1P<0.05Fig.1 Effect of diazepamon spontaneous beats of isolated rat right atriumCompared with 0μmol·L-1diazepam,*1P<0.05

2.2 地西泮對(duì)體外大鼠左心房興奮性的影響 用頻率1 Hz,波寬分別為0.2,0.5,1,3,5,10 ms的方波刺激左心房,測定閾電位,繪制出波寬-閾電位的興奮性曲線。見表1。0.175,1.75μmol·L-1地西泮不明顯影響左心房的興奮性曲線,而17.5μmol·L-1地西泮可使左心房興奮性曲線右移,降低左心房的興奮性。

表1 不同濃度地西泮在不同波度下對(duì)體外大鼠左心房興奮性閾電壓的影響Tab.1 Effect of different concentration of diazepamon the excitability of isolated rat left atriumdifferent wave-width V,±s

表1 不同濃度地西泮在不同波度下對(duì)體外大鼠左心房興奮性閾電壓的影響Tab.1 Effect of different concentration of diazepamon the excitability of isolated rat left atriumdifferent wave-width V,±s

與0μmol·L-1比較,*1P<0.05Compared with 0μmol·L-1diazepam,*1P<0.05

地西泮濃度/ (μmol·L-1)0.2 ms 0.5ms 1 ms 3ms 5ms 10ms 0.0 2.445±1.421 1.581±0.957 1.272±0.748 1.061±0.646 1.008±0.641 0.956±0.633 0.175 2.419±1.425 1.538±0.962 1.254±0.758 1.074±0.655 1.034±0.660 0.996±0.666 1.75 2.434±1.461 1.578±0.985 1.288±0.791 1.106±0.691 1.061±0.692 1.035±0.705 17.5 2.788±1.759 1.797±1.189 1.455±0.946 1.266±0.829*11.233±0.834*11.206±0.847*1

2.3 地西泮對(duì)體外心肌收縮力的影響 地西泮終濃度為0.017 5,0.052 5,0.175,0.525,1.75,5.25, 17.5μmol·L-1時(shí),可濃度依賴性地降低體外大鼠右心房心肌收縮力。但當(dāng)?shù)匚縻鷿舛冗M(jìn)一步增加達(dá)52.5,175.0μmol·L-1時(shí),體外大鼠右心房心肌收縮力不減弱,反而有上升趨勢。

地西泮濃度為0.017 5,0.052 5,0.175,0.525, 1.75,5.25,17.5μmol·L-1時(shí),對(duì)體外大鼠左心房心肌收縮力呈抑制趨勢,但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)；當(dāng)濃度達(dá)52.5,175.0μmol·L-1時(shí),呈抑制趨勢的左心房心肌收縮力依濃度又恢復(fù)至給藥前水平。但當(dāng)?shù)匚縻鷿舛葹?75.0μmol·L-1時(shí),可使刺激誘導(dǎo)收縮的7只體外左心房停跳,停搏率達(dá)46.67%。統(tǒng)計(jì)分析未停搏的心肌收縮力變化見表2。

表2 地西泮對(duì)離體大鼠左右心房心肌收縮力的作用Tab.2 Effect of diazepamon contractile force of isolated rat right and left atriumof rats g,±s

表2 地西泮對(duì)離體大鼠左右心房心肌收縮力的作用Tab.2 Effect of diazepamon contractile force of isolated rat right and left atriumof rats g,±s

與0.0μmol·L-1地西泮比較,*1P<0.05;與0.175μmol·L-1地西泮比較,*2P<0.05Compared with 0.0μmol·L-1diazepam,*1P<0.05; compared with 0.175μmol·L-1diazepam,*2P<0.05

濃度/ (μmol·L-1)右心房(n＝10)左心房( n＝8) 0.0 0.206±0.104 0.251±0.166 0.017 5 0.198±0.103 0.261±0.154 0.052 5 0.186±0.105 0.252±0.136 0.175 0.196±0.114 0.253±0.138 0.525 0.172±0.095*1*20.229±0.118 1.75 0.174±0.097*1*20.209±0.106 5.25 0.170±0.098*1*20.205±0.098 17.5 0.167±0.099*1*20.204±0.095 52.5 0.202±0.147 0.239±0.135 175.0 0.237±0.183 0.252±0.164

2.4 地西泮對(duì)左心房FRP的影響 地西泮濃度為0.175μmol·L-1時(shí),可明顯延長左心房FRP；當(dāng)濃度繼續(xù)增加為1.75,17.5μmol·L-1,則對(duì)左心房FRP無明顯影響,見圖2。

2.5 地西泮對(duì)體外大鼠乳頭肌快反應(yīng)動(dòng)作電位的影響 0.175,1.75,17.5μmol·L-1地西泮對(duì)體外大鼠乳頭肌快反應(yīng)動(dòng)作電位的靜息電位、動(dòng)作電位時(shí)程作用不明顯；17.5μmol·L-1地西泮可明顯降低動(dòng)作電位振幅(APA)(圖3),沖洗后,APA可部分恢復(fù)。

3 討論

圖2 地西泮對(duì)大鼠體外左心房功能性不應(yīng)期的影響與0.0μmol·L-1地西泮比較,*1P<0.05Fig.2 Effect of diazepamon functional refractory period (FRP)of isolated rat left atriumCompared with 0.0μmol·L-1diazepam,*1P<0.05

圖3 地西泮對(duì)體外大鼠乳頭肌動(dòng)作電位幅度的影響與0.0μmol·L-1地西泮比較,*1P<0.05Fig.3 Effect of diazepamon action potential amplitude (APA)of isolated rat papillary musclesCompared with 0.0μmol·L-1diazepam,*1P<0.05

地西泮藥理作用以抗焦慮和鎮(zhèn)靜催眠作用為主［6］。臨床報(bào)道地西泮可用于治療心肌梗死和心律失常［4-5］。以往認(rèn)為這與其強(qiáng)大的鎮(zhèn)靜作用從而降低耗氧量、改善心肌供血有關(guān)。本研究證明,地西泮對(duì)體外大鼠心肌有直接作用。當(dāng)?shù)匚縻鷿舛冗_(dá)17.5,52.5,87.5和175.0μmol·L-1時(shí),可使部分右心房標(biāo)本驟然停搏,累積停搏率分別為5.56%,16.67%,27.78%和77.78%。對(duì)未停搏的11只標(biāo)本觀察發(fā)現(xiàn),累積終濃度達(dá)到52.5 μmol·L-1時(shí)地西泮開始對(duì)自搏頻率表現(xiàn)出顯著的抑制效應(yīng)(P<0.05)。地西泮對(duì)體外心房心肌收縮力有直接影響。地西泮低濃度時(shí)降低左、右心房心肌收縮力,且具有濃度依賴性。累積終濃度達(dá)到0.525μmol·L-1時(shí)右心房收縮力開始有顯著降低,由給藥前的(0.206±0.104)g降為(0.172±0.095)g。隨著濃度繼續(xù)升高,心肌收縮力持續(xù)下降,在終濃度為17.5μmol·L-1時(shí)收縮力降至最低,為(0.167± 0.099)g。繼續(xù)增加地西泮濃度時(shí),收縮力不再降低,反而略有上升,分別升至終濃度為52.5μmol·L-1時(shí)的(0.202±0.147)g和終濃度為175.0μmol·L-1時(shí)的(0.237±0.183)g。地西泮對(duì)左心房的心肌收縮力影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但總體趨勢與對(duì)右心房的影響相同,即在一定的濃度范圍(0.175～17.5μmol·L-1)抑制心肌收縮力,濃度繼續(xù)增加時(shí)收縮力不降反升。但當(dāng)?shù)匚縻鷿舛葹?75.0μmol·L-1時(shí),可使刺激誘導(dǎo)收縮的7只體外左心房停跳,停搏率達(dá)46.67%。據(jù)此認(rèn)為地西泮在特定的濃度范圍對(duì)心肌收縮力呈現(xiàn)抑制效應(yīng),可減輕心肌耗氧量,對(duì)心肌細(xì)胞有保護(hù)作用。

分別給予左心房肌標(biāo)本0.2,0.5,1,3,5,10 ms的刺激時(shí),閾刺激強(qiáng)度與給藥前相比均有升高趨勢,但只有在地西泮濃度為17.5μmol·L-1時(shí),在3,5,10ms波寬下,閾刺激強(qiáng)度與給藥前相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。據(jù)此認(rèn)為地西泮應(yīng)用于心血管疾病的安全性比較高,小劑量地西泮對(duì)心臟影響小,基本無副作用,可通過作用于大腦邊緣系統(tǒng)發(fā)揮其抗焦慮作用,改善緊張、憂慮、激動(dòng)和失眠等癥狀。研究證明小劑量地西泮短期應(yīng)用既發(fā)揮抗焦慮作用又不會(huì)產(chǎn)生依賴。較大劑量地西泮對(duì)心臟有抑制效應(yīng),可降低心率及心肌收縮力,從而減少心肌耗氧量,對(duì)心肌梗死及心律失常有一定的保護(hù)作用,尤其對(duì)冠心病、高血壓和兒茶酚胺引起的快速性心律失常更為有效。

實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),低濃度的地西泮(0.175μmol·L-1)可延長左心房功能性不應(yīng)期,中、高濃度地西泮(1.75, 17.5μmol·L-1)對(duì)左房功能性不應(yīng)期無顯著影響,可見低濃度的地西泮對(duì)心肌細(xì)胞亦有一定的保護(hù)作用,通過延長功能性不應(yīng)期,促進(jìn)心臟的收縮和舒張交替進(jìn)行,有利于心室的充盈和射血。APA隨地西泮濃度升高呈下降趨勢,在17.5μmol·L-1濃度下APA顯著降低,體現(xiàn)高濃度的地西泮對(duì)心臟有較明顯的抑制作用。實(shí)驗(yàn)條件下,地西泮不影響乳頭肌快反應(yīng)動(dòng)作電位的動(dòng)作電位時(shí)程及靜息電位。

已有研究表明,腦內(nèi)有地西泮高親和力的特異結(jié)合位點(diǎn)苯二氮 受體［7］。其分布以皮質(zhì)為最密,其次為邊緣系統(tǒng)和中腦,再次為腦干和脊髓。這種分布狀況與中樞抑制性遞質(zhì)γ-氨基丁酸(gamma-amino butyric acid, GABA)的受體分布基本一致。電生理實(shí)驗(yàn)證明,苯二氮類能增強(qiáng)GABA能神經(jīng)傳遞功能和突觸抑制效應(yīng)；還有增強(qiáng)GABA與GABA受體相結(jié)合的作用。GABA受體是氯離子(Cl-)通道的門控受體,由兩個(gè)α和兩個(gè)β亞單位構(gòu)成Cl-通道。β亞單位上有GABA受點(diǎn),當(dāng)GABA與之結(jié)合時(shí),Cl-通道開放,Cl-內(nèi)流,使神經(jīng)細(xì)胞超復(fù)極,產(chǎn)生抑制效應(yīng)。在α亞單位上則有苯二氮 受體,苯二氮 與之結(jié)合時(shí),并不能使Cl-通道開放,但它通過促進(jìn)GABA與GABA受體的結(jié)合而使Cl-通道開放的頻率增加,更多的Cl-內(nèi)流。本實(shí)驗(yàn)證明地西泮對(duì)心肌有直接作用,推測心肌細(xì)胞上可能亦存在有Cl-通道,地西泮促進(jìn)Cl-內(nèi)流,使心肌細(xì)胞超復(fù)極,最大復(fù)極電位水平絕對(duì)值增大,離閾電位遠(yuǎn),自動(dòng)除極化達(dá)閾電位的時(shí)間延長,自律性降低。目前,全細(xì)胞水平的Cl-電流共有7種［6］:由環(huán)磷酸腺苷-蛋白激酶A(PKA)所激活的Cl-電流(ICl.PKA)；蛋白激酶C(PKC)所激活的Cl-電流(ICl.PKC)；由嘌呤受體(細(xì)胞外ATP等)激活的氯離子電流(ICl.ATP)；由細(xì)胞內(nèi)鈣激活的Cl-電流(ICl.Ca)；由細(xì)胞腫脹所激活的外向Cl-電流(ICl.swell)；背景基礎(chǔ)外向氯離子電流(ICl.b)；由超極化和細(xì)胞腫脹所激活的內(nèi)向整流性Cl-電流(ICl.ir)。地西泮對(duì)心肌標(biāo)本收縮力、興奮性、及動(dòng)作電位幅度均有不同程度的抑制作用,一定濃度的地西泮還可延長左房功能性不應(yīng)期,推測應(yīng)與這些氯離子電流有關(guān),但本實(shí)驗(yàn)尚不能解釋具體是哪種或幾種Cl-電流在起作用,還需進(jìn)一步研究。

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DOI 10.3870/yydb.2014.02.005

Effect of Diazepamon Myocardial Physiological Properties and Action Potentials of Rat

LI Fan-Fan,LI Jie,WANG Jia-ling,XIAO Jun-hua
(Department of Pharmacology,Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China)

Objective To study the effects of diazepamonmyocardial physiological properties and action potential in rats.MethodsThe spontaneous beats,contractile force,functional refractory period and excitability of isolated atrialmuscles were recorded according to the regularmethods.Standard microelectrode intracellular recording technique was used to record the action potential of ventricular papillarymuscles.ResultsDiazepam(0.017 5-5.25μmol·L-1)did notmarkedly affect spontaneous beats of the right atrium.Diazepam(17.5-175.0μmol·L-1)reduced the frequency of spontaneous beats in a concentration-dependentmanner.Diazepamat the low dose(0.175μmol·L-1)extended the functional refractory period of the isolated left atrium.Diazepamat the high dose(17.5μmol·L-1)decreased the excitability of left atriumand significantly reduce the action potential amplitude.ConclusionDiazepamexerts direct effectsonmyocardial spontaneousbeats,contractile force,functional refractory period,excitability and action potential.

Diazepam;Myocardium;Physiological properties;Action potential

R971.3;R965

A

1004-0781(2014)02-0152-04

2013-05-02

2013-08-07

*中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(2011TS071)；華中科技大學(xué)2010年第一批大學(xué)生創(chuàng)業(yè)創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目(0109510802)。

李璠璠(1988-),女,湖北棗陽人,在讀碩士,研究方向:圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)。電話:(0)15872421509,E-mail：845869565@qq.com。

肖軍花(1975-),女,湖北荊門人,副教授,碩士生導(dǎo)師,研究方向:心血管藥理。電話:027-83657736,E-mail：xiaoj@mail.hust.edu.cn。