魏雯，高婷婷，譚勇，武振華

(1．新疆特種植物藥資源省部共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子大學(xué)藥學(xué)院，石河子 832002；2．中國科學(xué)院近代物理研究所，蘭州 730000；3．中國科學(xué)院重離子束輻射生物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730000)

紫蘇不同部位的體外抑菌作用*

魏雯1，高婷婷1，譚勇1，武振華2，3

(1．新疆特種植物藥資源省部共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子大學(xué)藥學(xué)院，石河子 832002；2．中國科學(xué)院近代物理研究所，蘭州 730000；3．中國科學(xué)院重離子束輻射生物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730000)

目的研究紫蘇不同部位、不同提取物的體外抑菌實(shí)驗(yàn)效果。方法采用藥敏紙片法分別測定紫蘇籽油、紫蘇葉和紫蘇籽皮不同提取物對大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、八疊球菌、金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑,采用二倍稀釋法測定最低抑菌濃度(MIC)。結(jié)果紫蘇葉和紫蘇籽皮水浸液對枯草芽孢桿菌的抑菌最強(qiáng),MIC分別為62.5和125 mg·mL-1。結(jié)論紫蘇葉和紫蘇籽皮水浸液、水煎液、醇提液對4種菌均有抑菌作用,水浸液對4種菌的抑菌作用較強(qiáng),尤其是對枯草芽孢桿菌的抑菌作用最強(qiáng)。

紫蘇；抑菌作用；紙片法；二倍稀釋法

紫蘇(Perilla frutescensL.Britt.)是唇形科紫蘇屬一年生草本植物,為常用中藥之一,也是我國前衛(wèi)生部公布的既是藥品又是食品中的60種中藥之一［1］。紫蘇子具有降氣化痰、止咳平喘、潤腸通便的作用。用于痰壅氣逆、咳嗽氣喘、腸燥便秘［2］。筆者對紫蘇不同部位用不同溶劑處理后對大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、八疊球菌、金黃色葡萄球菌的抑菌情況進(jìn)行實(shí)驗(yàn),并比較不同部位、不同提取物的抑菌情況,旨在為紫蘇天然防腐劑的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù),提高紫蘇的利用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 儀器 調(diào)溫電熱套(KDM型調(diào)溫電熱套,山東省鄄城永興儀器廠)；DL-720超聲波清洗機(jī)(浙江象山縣石浦海天電子儀器廠)；LDZX-30FBS立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)；SHA-C水浴恒溫振蕩器(金壇市醫(yī)療儀器廠)；DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)；BCD-239SK DC電冰箱(青島海爾股份有限公司)；移液槍(上海狄士醫(yī)療器械有限公司)。

1.2 藥品與試劑 紫蘇藥材,產(chǎn)地:新疆瑪納斯,經(jīng)石河子大學(xué)藥學(xué)院李鵬副教授鑒定為紫蘇(Perilla frutescensL.Britt.)。

1.3 菌種 八疊球菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌由石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室提供,大腸埃希菌由石河子大學(xué)藥學(xué)院病理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.4 藥液的提取

1.4.1 紫蘇油 由紫蘇籽壓榨得到紫蘇油(Ⅰ)。

1.4.2 紫蘇籽皮水浸液 將紫蘇籽皮粉碎后過內(nèi)徑0.250 mm(60目)篩,稱取10 g,加純化水150 mL浸泡,隔一段時(shí)間翻動(dòng)一次,浸泡24 h,過濾,取其濾液,濃縮至5 mL,使其濃度為2 g·mL-1(Ⅱ)。

1.4.3 紫蘇籽皮水煎液 將紫蘇籽皮粉碎后過內(nèi)徑0.250 mm(60目)篩,稱取10 g,加純化水150 mL浸泡30 min后,煮沸30 min,三層紗布過濾。濾渣加純化水60mL再煮沸30min,過濾。合并濾液并濃縮至5mL,使其濃度為2 g·mL-1(Ⅲ)。

1.4.4 紫蘇籽皮醇提液 將紫蘇籽皮粉碎過內(nèi)徑0.250 mm(60目)篩,稱取10 g,加入無水乙醇50 mL,超聲20 min,過濾,殘?jiān)偌尤霟o水乙醇50 mL,再超聲20 min,如此反復(fù)4次,合并過濾液,濃縮至5 mL,使其濃度為2 g·mL-1(Ⅳ)。

1.4.5 紫蘇葉水浸液 將紫蘇葉粉碎后過內(nèi)徑0.250 mm(60目)篩,稱取10 g,加純化水150 mL浸泡,隔一段時(shí)間翻動(dòng)一次,浸泡24 h,過濾,取其濾液,濃縮至5 mL,使其濃度為2 g·mL-1(V)。

1.4.6 紫蘇葉水煎液 將紫蘇葉粉碎后過內(nèi)徑0.250 mm(60目)篩,稱取10 g,加入純化水150 mL浸泡30 min后,煮沸30 min,三層紗布過濾。濾渣加純化水60 mL再煮沸30 min,過濾。合并濾液并濃縮至5 mL,使其濃度為2 g·mL-1(Ⅵ)。

1.4.7 紫蘇葉醇提液 將紫蘇葉粉碎過內(nèi)徑0.250 mm(60目)篩,稱取10 g,加入無水乙醇50 mL,超聲20 min,過濾,殘?jiān)偌尤霟o水乙醇50 mL,再超聲20 min,如此反復(fù)4次,合并過濾液,濃縮至5 mL,使其濃度為2 g·mL-1(Ⅶ)。

1.5 培養(yǎng)基的制備［3］

1.5.1 固體培養(yǎng)基 瓊脂粉(優(yōu)質(zhì))12 g,蛋白胨10 g,牛肉膏、氯化鈉各5 g,純化水1 L,pH7.2～7.4, 121℃滅菌20 min。

1.5.2 液體培養(yǎng)基 蛋白胨10 g,牛肉膏、氯化鈉各5 g,純化水1 L,pH7.2～7.4,121℃滅菌20 min。

1.6 菌液的制備 在無菌條件下,用接種環(huán)將貯存的菌液用平板畫線法接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中, 37℃下培養(yǎng)24 h復(fù)壯；取復(fù)壯后菌種再接種于LB培養(yǎng)基,制成菌懸液,37℃培養(yǎng)24 h,待用。

1.7 抑菌實(shí)驗(yàn)

1.7.1 藥敏紙片法 將LB固體瓊脂培養(yǎng)基15 mL溶化后,傾注于培養(yǎng)皿上,待冷凝固后,加入供試菌懸液0.4 mL菌懸液于平板中央,用涂布棒將菌液均勻涂布,無菌操作。將藥敏紙片置于藥液中浸泡4 h滅菌陰干,貼于含菌培養(yǎng)基上,每皿放置4片,各紙片間的距離均等,每一樣品重復(fù)3次,同時(shí)用浸有溶劑的濾紙片做陰性對照,用浸泡過慶大霉素注射液的紙片做陽性對照。將放置過藥敏片的培養(yǎng)皿蓋上平皿蓋,置于37℃倒置培養(yǎng)24 h,觀察結(jié)果,用十字交叉法測量抑菌圈直徑,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值［4］。

1.7.2 二倍稀釋法 取制備好的提取液,原液濃度為2 000mg·mL-1。取11支無菌試管,于每管先加入LB培養(yǎng)基1 mL,然后向第1管加入滅菌的提取物原液1 mL,混勻后吸取1 mL加入第2管中,混勻后吸取1 mL加入第3管中,依次類推,對藥液進(jìn)行2倍倍比稀釋,直至第9管,第9管吸取1 mL棄去,使各管提取物濃度依次為原液濃度的1/2,1/4,1/8,1/16,1/32,1/ 64,1/128,1/256,1/512。試管中提取物濃度依次為1 000,500,250,125,62.5,31.3,15.6 mg·mL-1……；第10管僅加受試中草藥提取物1 mL,以便觀察受試中草藥是否被污染；第11管僅加菌液作為對照,以觀察細(xì)菌的生長情況［5-7］。取培養(yǎng)好的菌液100μL接種于前9支試管中,37℃下培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。用肉眼觀察,不發(fā)生渾濁、沉淀、表面生長任一現(xiàn)象的最高提取物稀釋倍數(shù)為該提取物的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)［8］。

2 結(jié)果

2.1 紙片法測定7種提取物對4種菌的抑菌作用結(jié)果 結(jié)果見表1。由表1可見,紫蘇油對4種菌均無抑菌作用,紫蘇籽皮和紫蘇葉不同提取物對4種菌均有不同程度的抑制作用。紫蘇籽皮水浸液對枯草桿菌的抑菌作用相對較強(qiáng),紫蘇葉水浸液對枯草桿菌和八疊球菌的抑菌作用相對較強(qiáng),紫蘇籽皮水煎液和紫蘇葉水煎液對4種菌的抑菌作用均較弱,紫蘇籽皮和紫蘇葉醇提液對八疊球菌均沒有抑制作用,對枯草桿菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌有較弱的抑菌作用。

表1 紫蘇葉、籽皮不同提取物對4種菌的平均抑菌圈直徑Tab.1 Average inhibitory diameter of different extracts fromperilla leaves and seed peel on four kinds of pathogenic bacteria cm

2.2 MIC值結(jié)果 為了進(jìn)一步證實(shí)紫蘇不同部位、不同提取物的活性,用二倍稀釋法測定抑菌活性較強(qiáng)的紫蘇籽皮和紫蘇葉水浸液對4種菌的MIC值,第10支試管無任何細(xì)菌生長,說明受試中草藥無污染；第11支試管發(fā)生渾濁,說明細(xì)菌正常生長。見表2。由表2可知,紫蘇籽皮水浸液對枯草桿菌的MIC為125 mg·mL-1,對八疊球菌的MIC為500 mg·mL-1,對金黃色葡萄球菌的MIC為250 mg·mL-1。紫蘇葉水浸液對枯草桿菌的MIC為62.5 mg·mL-1,對八疊球菌的MIC為250 mg·mL-1,對金黃色葡萄球菌的MIC為125 mg·mL-1。

表2 紫蘇籽皮和紫蘇葉水浸液對枯草桿菌、八疊球菌、金黃色葡萄球菌的MICTab.2 MIC of infusion of perilla leaves and seed peel on Bacillus subtilis,Sarcina and Staphylococcus aureus

3 討論

紫蘇葉和紫蘇籽皮水浸液、水煎液、醇提液對4種菌均有不同程度的抑菌作用,其中紫蘇葉和紫蘇籽皮水浸液對4種菌的抑菌作用較強(qiáng)。紫蘇籽皮水浸液和紫蘇葉水浸液對革蘭陽性菌(金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、八疊球菌)和革蘭陰性菌(大腸埃希菌)都有一定的抑菌作用,對4種菌的抑菌能力依次均為:枯草桿菌>八疊球菌>金黃色葡萄球菌>大腸埃希菌,由此可知紫蘇對革蘭陽性菌的抑菌能力較強(qiáng)。

防腐劑的MIC值越小,其抑菌能力越強(qiáng)。紫蘇葉水浸液對枯草桿菌的MIC最小,說明對枯草桿菌的抑菌能力最強(qiáng),為食品天然防腐劑領(lǐng)域中開發(fā)一種高效、低毒、廣譜和經(jīng)濟(jì)實(shí)用的天然防腐劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),也為紫蘇的綜合利用開辟一條新途徑。

目前對于紫蘇抑菌作用的研究較多,提取方法各異,但筆者未見有關(guān)紫蘇籽皮抑菌作用的報(bào)道。紫蘇籽皮通常不被人們注意而被遺棄和浪費(fèi),本研究發(fā)現(xiàn)紫蘇籽皮具有很好的抑菌作用,為進(jìn)一步拓展紫蘇的藥用部位提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),為紫蘇天然防腐劑的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù),對提高紫蘇的利用價(jià)值具有重要意義。

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DOI 10.3870/yydb.2014.02.004

Antibacterial Activity of Different Parts of Purple Perilla in Vitro

WEI Wen1,GAO Ting-ting1,TAN Yong1,WU Zheng-hua2,3
(1.Provincial Special Herbal Medicine Resources in Xinjiang Key Laboratory,College of Pharmacy,Shihezi University,Shihezi 832002,China;2.Institute of Modern Physics,Chinese Academy of Sciences,Lanzhou 730000,China;3.The Chinese Academy of Sciences Key Laboratory of Heavy Ion Radiation Biological Medicine,Lanzhou 730000,China)

Objective To studyin vitroantibacterial activity of extracts fromdifferent parts of purple perilla.MethodsThe antibacterial activity of perilla seed oil,perilla leaves and seed peel against Escherichia coli,Bacillus subtilis, Sarcina and Staphylococcus aureuswas studied by the disk diffusion susceptibility test(Kir-by-Bauer).The minimuminhibitory concentration(MIC)was determined by tube double dilution method.ResultsExtracts of perilla leaves and seed peel by water immersion extraction exerted the best antibacterial effect on Bacillus subtilis,with the MIC of 62.5 and 125 mg·mL-1, respectively.ConclusionThe extracts of perilla leaf and perilla peel by water immersion,water decoction and alcohol extraction have distinct antibacterial effects against four kinds of bacteria.The extracts by water immersion exert stronger antibacterial effects,especially to Bacillus subtilis.

Perilla;Bacteriostasis;Kir-by-Bauer;Double dilutionmethod

R282.71;R285.5

A

1004-0781(2014)02-0149-03

2013-04-22

2013-07-12

*中國科學(xué)院科技支新項(xiàng)目(Y160040YD0)；石河子大學(xué)“3152”青年骨干教師項(xiàng)目資助

魏雯(1988-),女,新疆塔城人,在讀碩士,研究方向:藥用植物資源及中藥藥理。電話:(0)13239933400,E-mail：409495233@qq.com。

譚勇(1976-),男,教授,碩士生導(dǎo)師,博士,研究方向:藥用植物資源及天然產(chǎn)物化學(xué)。電話:(0) 13579762501,E-mail：xjty321@163.com。