王瑩,郭飛燕,王鵬遠(yuǎn),賀文娟,王曉娟

(第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院藥劑科,軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實驗室,西安 710032)

花芪顆粒質(zhì)量控制*

王瑩,郭飛燕,王鵬遠(yuǎn),賀文娟,王曉娟

(第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院藥劑科,軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實驗室,西安 710032)

目的 建立花芪顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法采用薄層色譜法對花芪顆粒中黃芪、生地、麥冬和當(dāng)歸進(jìn)行定性鑒別。采用高效液相色譜法測定生地中梓醇的含量,色譜柱:Diamonsil?C18(2)分析柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相:乙腈-0.1%磷酸溶液(0.5∶99.5),流速:1.0 mL·min-1,柱溫:25℃,檢測波長:210 nm,進(jìn)樣量:10 μL。結(jié)果黃芪、生地、麥冬和當(dāng)歸的薄層色譜斑點(diǎn)清晰,陰性對照無干擾,專屬性強(qiáng)。梓醇在0.241～0.724 mg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好(r=0.999 8),平均加樣回收率為95.19%,RSD為3.20%(n=9)。結(jié)論該方法能準(zhǔn)確可靠地進(jìn)行定性、定量分析,可用于花芪顆粒的質(zhì)量控制。

花芪顆粒;梓醇;質(zhì)量控制;色譜法,薄層;色譜法,高效液相

口干是口腔疾病及某些系統(tǒng)疾病的常見癥狀之一,是口腔內(nèi)唾液缺乏所引起的一種癥狀,針對口干癥的病因進(jìn)行治療,是最有效的方法。中醫(yī)將口干燥癥歸之為“燥癥”范疇,陰虛致燥為根本原因,治則為滋陰生津、潤燥健脾。治療采用的中藥主要有生地、熟地、麥冬、當(dāng)歸、石斛、玉竹等[1-2]?；ㄜ晤w粒主要由生地、黃芪、麥冬、天冬、當(dāng)歸、石斛、白花蛇舌草、莪術(shù)、半枝蓮、三棱和肉蓯蓉等11味中藥材經(jīng)提取、濃縮后制成,可用于治療干燥綜合征、老年性口干癥、藥物及精神因素引起的口干癥、經(jīng)前期及絕經(jīng)期引起的口干癥等。為了有效控制其質(zhì)量,筆者采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法對花芪顆粒中君藥生地進(jìn)行含量測定,并對花芪顆粒中各味藥材進(jìn)行薄層色譜(thin-layer chromatography,TLC)研究,最終確定黃芪、生地、麥冬和當(dāng)歸的薄層色譜鑒別條件。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-2010A高效液相色譜儀,紫外檢測器, LC-Solution色譜工作站(日本島津制作所);DL-720超聲儀(浙江石浦海天電子儀器廠);BT125D分析天平(精度:0.01/0.1 mg;量程:40/120 g,北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試藥 梓醇對照品(批號:110808-201009,純度: 94.4%)、黃芪甲苷對照品(供含量測定用,批號: 110781-200613)、阿魏酸對照品(供含量測定用,批號: 110773-201012)、麥冬對照藥材(批號:121013-201009)和生地對照藥材(批號:121180-200604)均購自中國食品藥品檢定研究院?；ㄜ晤w粒[蘭制字(2011)F70006]3批(批號:121126,130119,130305),由第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院藥劑科提供;甲醇、乙腈為色譜純,其他試劑均為分析純,水為二次純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 黃芪薄層鑒別 取花芪顆粒12 g,研細(xì),加正丁醇30 mL加熱回流1 h,濾過,濾液加于中性氧化鋁柱(100～120目,5 g,內(nèi)徑10～15 mm)上,用1%氫氧化鈉溶液100 mL洗脫3次,收集洗脫液,棄去堿液,再用正丁醇飽和的水洗脫3次至溶液呈中性,棄去水層,正丁醇蒸干,殘渣加甲醇1 mL溶解,作為供試品溶液;另取黃芪甲苷對照品,加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液,作為對照品溶液;再取陰性顆粒12 g和黃芪對照藥材2 g,按照供試品溶液的制法制成陰性對照品溶液和對照藥材溶液。照薄層色譜法(《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄ⅥB)實驗,吸取上述4種溶液各2 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以三氯甲烷∶甲醇∶水(13∶7∶2)的下層溶液為展開劑,展開,取出,晾干,噴以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰,置波長365 nm紫外燈下檢視。供試品色譜中,在與對照品色譜相應(yīng)的位置上(Rf值相同,Rf=0.68),日光下顯相同的棕褐色斑點(diǎn);紫外燈(波長365 nm)下,顯相同的橙黃色熒光斑點(diǎn),且陰性無干擾,薄層色譜結(jié)果見圖1。

2.1.2 生地薄層鑒別 稱取花芪顆粒8 g,研細(xì),加甲醇20 mL,超聲提取20 min,過濾,濾液回收甲醇至5 mL,作為供試品溶液。取生地對照藥材2 g和陰性顆粒8 g,同上處理,作為對照藥材溶液和陰性對照品溶液。照薄層色譜法實驗,吸取上述4種溶液各5 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以三氯甲烷-甲醇-水(14∶6∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以香草醛硫酸試液,105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中,在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上(Rf值相同,Rf= 0.39),顯相同顏色的斑點(diǎn),且陰性無干擾,薄層色譜結(jié)果見圖2。

圖1 黃芪的薄層色譜圖

圖2 生地的薄層色譜圖

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2.1.3 麥冬薄層鑒別 稱取花芪顆粒劑24 g,研細(xì),加三氯甲烷-甲醇(7∶3)混合溶液20 mL,浸泡3 h后,超聲處理30 min,放至室溫,濾過,濾液蒸干,殘渣加三氯甲烷1 mL使之溶解,作為供試品溶液。另取麥冬對照藥材0.25 g和陰性顆粒24 g,同法制成對照藥材溶液和陰性對照溶液。照薄層色譜法,吸取上述3種溶液各10 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G254薄層板上,以甲苯-甲醇-冰醋酸(80∶5∶0.1)為展開劑,展開,取出,晾干,置紫外光燈(波長254 nm)下檢視。供試品色譜中,在與對照藥材色譜相應(yīng)位置上(Rf值相同,Rf= 0.28),出現(xiàn)相同顏色的清晰的斑點(diǎn),且陰性無干擾,薄層色譜圖結(jié)果見圖3。

圖3 麥冬的薄層色譜圖

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2.1.4 當(dāng)歸薄層鑒別 稱取花芪顆粒12 g,研細(xì),加1%碳酸氫鈉溶液50 mL,超聲處理30 min后,離心10 min,取上清液用10%稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至2～3,用乙醚振搖提取2次,每次20 mL,合并乙醚液,蒸干,殘渣加甲醇1 mL使溶解,作供試品溶液。另取阿魏酸對照品適量,加甲醇配成每毫升含1 mg的溶液,作為對照品溶液。再取陰性顆粒12 g和當(dāng)歸對照藥材0.5 g,按照供試品溶液的制法制成陰性對照品溶液和對照藥材溶液。照薄層色譜法,吸取上述4種溶液各10 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(4∶1∶1∶0.1)為展開劑,展開,取出,晾干,置紫外燈(波長365 nm)下檢視。供試品色譜中,在與對照品相應(yīng)的位置上(Rf值相同,Rf=0.35),出現(xiàn)相同顏色的清晰的熒光斑點(diǎn),且陰性無干擾,薄層色譜結(jié)果見圖4。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱:Diamonsil?C18(2)分析柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相:乙腈-0.1%磷酸溶液(0.5∶99.5),流速:1.0 mL·min-1,柱溫:25℃,檢測波長:210 nm,進(jìn)樣量:10 μL。理論板數(shù)按梓醇峰計算應(yīng)不低于5 000。

2.2.2 溶液的配制

2.2.2.1 對照品溶液的配制 取梓醇對照品約10 mg,精密稱定為10.05 mg,置25 mL量瓶中,用二次純化水溶解并定容至刻度,搖勻,即得梓醇對照品儲備液(0.402 mg·mL-1)。精密量取對照品儲備液1 mL置10 mL量瓶中,加二次純化水稀釋并定容至刻度,得濃度為40.2 μg·mL-1的對照品溶液。

圖4 當(dāng)歸的薄層色譜圖

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2.2.2.2 供試品溶液的配制 取花芪顆粒適量(批號: 121126),研細(xì),稱取約12 g,精密稱定,置錐形瓶中,加入甲醇50 mL,稱定質(zhì)量,加熱回流1.5 h,放冷,再稱定質(zhì)量,用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,精密量取續(xù)濾液10 mL,蒸干,殘渣用二次純化水溶解,轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中,用二次純化水稀釋至刻度,搖勻,即得供試品溶液。進(jìn)樣前過篩孔內(nèi)徑0.45 μm微孔濾膜。

2.2.2.3 陰性對照溶液的配制 取處方比例不含生地的各成分,按花芪顆粒制備工藝制成陰性顆粒樣品,照供試品溶液的方法制備陰性對照溶液,備用。

2.2.3 專屬性考察 分別精密吸取空白溶劑及“2.2.2”項下對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液各10 μL,分別注入高效液相色譜儀中,進(jìn)行測定,記錄色譜圖(圖5)。結(jié)果表明:運(yùn)用此法測定梓醇含量時基線噪音小,陰性無干擾,專屬性強(qiáng);且理論板數(shù)實際計算值為10 667,符合要求。

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2.2.1”項下梓醇對照品溶液(40.2 μg·mL-1)6,8,10,12,14, 18 μL注入高效液相色譜儀中,進(jìn)行測定,以峰面積(Y)對梓醇的進(jìn)樣量(X)進(jìn)行線性回歸,得Y= 21 320X-248.8,r=0.999 8;結(jié)果顯示梓醇進(jìn)樣量在0.241～0.724 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度實驗 精密吸取同一濃度的對照品溶液,按“2.2.1”項下的色譜條件,連續(xù)進(jìn)樣5次,每次10 μL,記錄峰面積并計算其RSD,結(jié)果RSD為0.56%,精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性實驗 取同一批(批號:121126)的花芪顆粒樣品,按“2.2.2.2”項方法,分別制備5份供試品溶液,按“2.2.1”項色譜條件進(jìn)樣10 μL測定,測得梓醇含量平均值為0.21 mg·g-1,RSD為0.14%。

2.2.7 穩(wěn)定性實驗 取“2.2.2.2”項供試品溶液,按“2.2.1”項色譜條件進(jìn)樣分析,在0,2,4,6,8 h內(nèi)進(jìn)樣5次,記錄峰面積,計算得RSD為0.22%,表明供試品溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收率實驗 取已知含量的花芪顆粒(批號:121126)適量,研細(xì),稱取約6 g,精密稱定,分別精密加入梓醇對照品儲備液(濃度0.402 mg·mL-1)2.5,3.1,3.7 mL,加甲醇至50 mL,稱定質(zhì)量,按“2.2.2.2”項方法制備供試品溶液,按“2.2.1”項色譜條件進(jìn)樣10 μL測定,計算加樣回收率,結(jié)果見表1。結(jié)果表明:本方法的準(zhǔn)確度較好,平均回收率為95.19%,RSD為3.20%。

圖5 4種溶液的高效液相色譜圖

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表1 梓醇加樣回收率實驗結(jié)果 n=9

2.2.9 樣品含量測定 取3批樣品(批號:121126, 130119,130305),按“2.2.2.2”項下方法制備供試品溶液各兩份,按“2.2.1”項色譜條件進(jìn)樣10 μL測定,結(jié)果見表2。

表2 3批樣品中梓醇含量測定結(jié)果 mg·g-1

3 討論

花芪顆粒由多味中藥組成,成分較復(fù)雜,筆者通過參考文獻(xiàn)及多次實驗最終篩選出黃芪[3-8]、生地[8-9]、麥冬[5,8,10-11]和當(dāng)歸[6-9,12]4味藥材的提取方法及層析系統(tǒng),對其進(jìn)行鑒別。結(jié)果表明,各特征斑點(diǎn)清晰,陰性無干擾,可作為本制劑的定性檢測。麥冬的薄層色譜圖中,對照藥材有4個斑點(diǎn),而樣品中只有兩個,可能是由于制劑在制備過程中被提取入藥成分較少。

文獻(xiàn)報道測定中成藥(顆粒劑、煎劑和沖劑等)中梓醇含量時,采用的提取溶劑有雙蒸水、甲醇、75%乙醇等;提取方法有超聲提取,回流提取[13-17]。在本實驗研究中考察不同溶劑,不同提取方法及不同提取時間對梓醇提取效果的影響,發(fā)現(xiàn)藥物中輔料對本品的提取影響較大,最終確定以甲醇為溶劑,加熱回流1.5 h為提取方法。

梓醇為環(huán)烯醚萜苷類化合物,易溶于水、甲醇,在波長210 nm處有最大吸收,考慮到甲醇作為溶劑時的末端吸收[13],選擇二次純化水作為對照品的溶解溶劑,且在供試品的制備過程中,將甲醇蒸干,用二次純化水復(fù)溶,以減少甲醇末端吸收帶來的影響。同時,本實驗考察了不同流動相對梓醇測定峰形的影響。結(jié)果顯示乙腈-0.1%磷酸溶液(0.5∶99.5)作為流動相時梓醇的分離度好,峰形穩(wěn)定,故最終選擇其作為流動相。

通過本實驗建立的薄層色譜法和高效液相色譜法對本制劑進(jìn)行3批樣品的質(zhì)量控制,結(jié)果表明該方法簡便、穩(wěn)定、可靠,可作為該制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

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DOI 10.3870/yydb.2014.10.035

R286;R927.2

B

1004-0781(2014)10-1381-04

2013-09-04

2013-11-19

*軍隊醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高計劃(13ZJZ08)

王瑩(1988-),女,陜西延安人,碩士,從事中藥分析技術(shù)研究。電話:029-84773998,E-mail:wangying880913@ 126.com。

王曉娟(1962-),女,陜西咸陽人,主任藥師,碩士生導(dǎo)師,從事天然藥物化學(xué)與中藥新制劑研究。電話:029-84776189,E-mail:wxjyh231@fmmu.edu.cn。