喬曉芳

（河南省安陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)所，河南 安陽(yáng) 455000）

高效液相色譜法測(cè)定土霉素片的含量

喬曉芳

（河南省安陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)所，河南 安陽(yáng) 455000）

目的建立土霉素片的含量測(cè)定方法。方法高效液相色譜法。采用Luna-C18色譜柱，以0.05 mol/L草酸銨溶液-二甲基甲酰胺-0.2 mol/L磷酸氫二銨（70∶25∶5）為流動(dòng)相，用紫外檢測(cè)器在282 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)。結(jié)果土霉素片濃度在0.01～1 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好（r＝0.9990），平均回收率為100.1%。結(jié)論高效液相色譜法快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可用于土霉素片的含量測(cè)定。

土霉素片；含量測(cè)定；高效液相色譜法；抗生素微生物檢定法

土霉素為四環(huán)素類(lèi)抗生素。本品為廣譜抑菌劑。土霉素作用機(jī)制為藥物能特異性地與細(xì)菌核糖體30S亞基的A位置結(jié)合，抑制肽鏈的增長(zhǎng)和影響細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成。用于痢疾、沙眼、結(jié)膜炎、肺炎、中耳炎、皮膚化膿感染等。亦用于治療阿米巴腸炎及腸道感染。土霉素片收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)抗生素分冊(cè)，其含量測(cè)定方法是用抗生素微生物檢定法二劑量法，方法步驟繁瑣，培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)[1]。現(xiàn)采用HPLC法，方法簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確。

1 儀器與試藥

日本島津LC-2010型高效液相色譜儀（自動(dòng)進(jìn)樣器，四元泵，紫外檢測(cè)器）；抑菌圈自動(dòng)測(cè)量?jī)xCAM-III。

土霉素對(duì)照品（批號(hào)：130487-200702，含量為93.6% 中國(guó)藥品生物制品檢定所），土霉素片（宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)20130107 20121203石家莊市協(xié)和藥業(yè)公司批號(hào)20130607）；磷酸氫二銨、草酸銨，二甲基甲酰胺、鹽酸均為分析純，水為超純水，空白樣品（是指不含土霉素，其余輔料按制劑壓片）自配。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

WH-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.05 mol/L草酸銨溶液-二甲基甲酰胺-0.2 mol/L磷酸氫二銨（70∶25∶5）；流速：0.9 mL/min，柱溫：30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：282 nm：進(jìn)樣量：20 μL[1]。

2.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：精密稱(chēng)取土霉素對(duì)照品約25 mg置25 mL量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液5 mL使溶解后，再加水至刻度，搖勻，制成每l mL含土霉素l mg的溶液，精密量取5 mL置50 mL量瓶中，再用0.01 mol/L鹽酸溶液稀釋至每l mL含土霉素0.1 mg的溶液。

供試品溶液：土霉素片（0.25克/片）取20片精密稱(chēng)定重量，精密稱(chēng)取適量（約相當(dāng)于土霉素25 mg）置25 mL量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液5 mL使溶解后，再加水，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液5 mL置50 mL量瓶中，加0.01 mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻即得每l mL含土霉素0.1 mg的溶液。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取土霉素對(duì)照品約25 mg置25 mL量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液5 mL使溶解后，再加水至刻度，搖勻，制成每l mL含土霉素l mg的溶液，精密量取5 mL置50 mL量瓶中，再用0.01 mol/L鹽酸溶液稀釋至每l mL含土霉素0.1 mg的溶液，搖勻。在上述色譜條件下，取上述20 μL自動(dòng)進(jìn)樣（圖1），計(jì)算柱效為6478，分離度符合要求，連續(xù)進(jìn)樣5次，峰面積的RSD＝0.48%。

2.4 空白干擾試驗(yàn)

取空白樣品（是指不含土霉素，其余輔料按制劑壓片）按測(cè)定方法依法操作，取20 μL自動(dòng)進(jìn)樣，記錄色譜圖，未見(jiàn)雜質(zhì)峰（圖2）。

2.5 線(xiàn)性關(guān)系考察

取上述土霉素對(duì)照品溶液（1.0 mg/mL），分別用0.01 mol/LHCL配制成0.01、0.025、0.050 、0.075、0.10、0.50、0.75、0.25 mg/mL，共9個(gè)濃度系列對(duì)照品溶液，分別精密吸取上述對(duì)照品溶液各20 μL注入色譜儀自動(dòng)進(jìn)樣，按擬定色譜條件測(cè)定。得各濃度峰面積，以峰面積為縱座標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程：Y＝-2.10636 ×10-3+2.0635×10-9X （r＝0.9999）。結(jié)果表明，土霉素片濃度在0.01～1 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.6 加樣回收試驗(yàn)

分別精密量取對(duì)照品溶液（1 mg/mL）5.00、3.75、2.50 mL置50 mL量瓶中，各加入處方比例量的空白樣品，用0.01 mol/L HCL稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，得0.1、0.075、0.05 mg/mL的溶液，按測(cè)定方法依法測(cè)定，自動(dòng)進(jìn)樣20 μL，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 HPLC法測(cè)定土霉素片回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=3）

圖1 對(duì)照品溶液HPLC

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取0.1 mg/mL對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣5次，每次20 μL，峰面積的RSD＝0.48%。上述同一份溶液于0、2、4、6、8 h分別進(jìn)樣20 μL，測(cè)定土霉素峰面積，結(jié)果RSD＝1.2% n＝5）。

2.8 樣品測(cè)定

取土霉素片按上述含量測(cè)定方法及抗生素微生物法測(cè)定法[2]，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品測(cè)定HPLC法與微生物法結(jié)果比（n=3）

3 討 論

3.1 色譜柱、流動(dòng)相及檢測(cè)波長(zhǎng)，參考鹽酸土霉素含量測(cè)定方法。使用C18柱和上述流動(dòng)相，均有較理想的分離效果及適當(dāng)?shù)谋Ａ魰r(shí)間，測(cè)定波長(zhǎng)選在282 nm也有滿(mǎn)意的吸收值。本實(shí)驗(yàn)使用進(jìn)口WH-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱效果更理想。

圖2 輔料溶液HPLC

3.2 線(xiàn)性關(guān)系考察

取土霉素對(duì)照品配制的0.01～1 mg/mL的9個(gè)濃度系列的溶液，測(cè)得各點(diǎn)的平均峰面積，并以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，求得回歸方程Y＝-2.10636×10-3+2.0635×10-9X，相關(guān)系數(shù)r為0.9999表明土霉素在0.01～1 mg/mL的濃度范圍內(nèi)有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

3.3 空白干擾試驗(yàn)：可看出空白樣品在土霉素峰保留時(shí)間處（約10 min）無(wú)明顯雜峰干擾。

3.4 加樣回收率試驗(yàn)：從表1數(shù)據(jù)可說(shuō)明本方法有較好的回收率100.1%。

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)，表明本法重復(fù)性較好RSD＝0.48%，溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定，能滿(mǎn)足測(cè)定的要求。

3.6 高效液相色譜法與微生物法比較，從表2數(shù)據(jù)表明HPLC法與抗生素微生物法結(jié)果近似，HPLC法完全可以取代抗生素微生物檢定法。用于土霉素片的含量測(cè)定[3]。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(二部)[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:462-463.

[2] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.藥品標(biāo)準(zhǔn)(抗生素藥品第一冊(cè))[S].1989.

[3] 楊開(kāi)金.紫外分光光度法與抗生素微生物檢定法測(cè)定土霉素含量方法比較[J].中國(guó)基層醫(yī)藥,2006,13(7):131.

Determination of the Content of Oxytetracycline Tablets by HPLC

QIAO Xiao-fang
(Anyang Institute for Food and Drug Control, Anyang 455000, China)

ObjectiveTo establish a method for determination of the content of Oxytetracycline tablets.MethodsHigh performance liquid chromatography. The WH-C18column, with 0.05 mol/L ammonium oxalate solution - two methyl formamide -0.2 mol/L diammonium hydrogen phosphate (70∶25∶5)as mobile phase, using a UV detector at 282 nm wavelength.ResultsOxytetracycline Tablets concentration relationship in 0.01-1 mg/mL scope with the peak area of linear(r= 0.9990), the average recovery rate was 100.1%.ConclusionThe HPLC method is rapid, simple and accurate, can be used for the content determination of Oxytetracycline tablets.

Oxytetracycline tablets; Content determination; HPLC; Microbiological method

R927.2

B

1671-8194（2014）21-0080-02