杜碧瑩（廣州市藥品檢驗所，廣州 510160）

環(huán)戊丙酸雌二醇為長效雌激素，其作用比戊酸雌二醇強(qiáng)而持久，維持時間在3～4周以上，臨床上主要用于卵巢功能不全、閉經(jīng)、更年期綜合征、老年性陰道炎及前列腺癌等；其與甲羥孕酮組成復(fù)方注射用避孕藥（全球通用藥名Lunelle），可作為每月1次長效避孕劑，已獲美國FDA認(rèn)可[1-2]。環(huán)戊丙酸雌二醇質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅在《美國藥典》（USP）36版[3]有收載，2010年版《中國藥典》以及現(xiàn)行版《英國藥典》《歐洲藥典》《日本藥局方》均無收載。而目前USP 36版及國內(nèi)研究并沒有對環(huán)戊丙酸雌二醇的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行定性定量研究，因此難以保證藥品質(zhì)量。本文建立了新的有關(guān)物質(zhì)檢查方法，并通過測定不同濃度雜質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算雜質(zhì)校正因子，從而提高了有關(guān)物質(zhì)控制的準(zhǔn)確性，以更好地對環(huán)戊丙酸雌二醇的質(zhì)量情況進(jìn)行評價。

1 材料

1.1 儀器

1200高效液相色譜（HPLC）儀系統(tǒng)、紫外檢測器、Chem Station工作站（美國Agilent公司）。

1.2 藥品與試劑

環(huán)戊丙酸雌二醇（USP對照品，批號:CAT NO.1252003，純度:99.9%，105 ℃干燥4 h后用）；雜質(zhì)Ⅰ[雌甾-1，3，5（10）-三烯-3，17-二醇，（17β）-，17-環(huán)戊乙酸酯，企業(yè)工作對照品，批號:ZP034-S003，純度:99.28%）；雜質(zhì)Ⅱ[雌甾-1，3，5（10），9（11）-四烯-3，17-二醇，（17β）-，17-環(huán)戊丙酸酯，企業(yè)工作對照品，批號:ZP034-S002，純度:98.58%）；環(huán)戊丙酸雌二醇原料藥（北京某公司，批號:20110941、20110942、20110943，純度:100.9%、99.9%、99.8%）；乙腈為色譜純，水為純凈水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Kromasil C18（以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，25 cm×4.6 mm，5 μm）；流動相:硝酸銨溶液（取0.8 g硝酸銨，溶解于300 ml水中）-乙腈（23∶77，V/V），流速:1.5 ml/min；柱溫:35 ℃；檢測波長:280 nm；進(jìn)樣量:50 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液。取環(huán)戊丙酸雌二醇原料藥適量，精密稱定，加溶劑[乙腈-水（70∶30）]溶解并定量稀釋制成每1 ml中約含1 mg的溶液，即得。

2.2.2 對照溶液。精密量取供試品溶液適量，加溶劑稀釋制成每1 ml中約含1 μg的溶液，即得。

2.2.3 對照品溶液。取雜質(zhì)Ⅱ?qū)φ掌愤m量，精密稱定，用溶劑溶解并定量稀釋制成每1 ml中約含2 μg的溶液，作為對照品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

取環(huán)戊丙酸雌二醇USP對照品、雜質(zhì)Ⅰ與雜質(zhì)Ⅱ?qū)φ掌愤m量，精密稱定，用溶劑溶解并定量稀釋制成每1 ml中含1 mg、1.5 μg、2 μg的混合溶液。取50 μl，注入液相色譜儀，環(huán)戊丙酸雌二醇的保留時間約為20 min；環(huán)戊丙酸雌二醇峰與雜質(zhì)Ⅱ的分離度應(yīng)大于2.0，理論板數(shù)按環(huán)戊丙酸雌二醇峰計不低于5000。系統(tǒng)適用性溶液和供試品溶液（批號:20110941）色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.系統(tǒng)適用性溶液；B.供試品溶液；1.雜質(zhì)Ⅰ；2.雜質(zhì)Ⅱ；3.環(huán)戊丙酸雌二醇Fig 1 HPLC chromatogramsA.system suitability solution；B.test solution；1.impurityⅠ；2.impurityⅡ；3.estradiol cypionate

2.4 不同色譜柱試驗

比較了不同牌號的色譜柱對分析的影響，各指標(biāo)結(jié)果見表1。

表1 不同色譜柱試驗結(jié)果Tab 1 Results of tests under different columns

試驗結(jié)果表明該流動相適用范圍較廣，選擇3種不同牌號的色譜柱均可適用，雜質(zhì)Ⅱ與環(huán)戊丙酸雌二醇的分離度均大于2.0。

2.5 線性關(guān)系試驗

分別取環(huán)戊丙酸雌二醇、雜質(zhì)Ⅰ與雜質(zhì)Ⅱ?qū)φ掌愤m量，用溶劑稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 μg/ml，0.3、0.6、0.9、1.5、2.0 μg/ml，0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 μg/ml的系列溶液進(jìn)行測定，以峰面積（y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，計算線性回歸方程，見表2。

表2 線性方程結(jié)果Tab 2 Linear equation

按最小二乘法以進(jìn)樣量對響應(yīng)值（峰面積等）進(jìn)行線性回歸，求得兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線，兩曲線斜率之比即為校正因子。雜質(zhì)Ⅰ相對校正因子為0.970，雜質(zhì)Ⅱ相對校正因子為0.368。

2.6 耐用性試驗

比較了不同流動相組成比例、pH、柱溫、流速、檢測波長等對測定結(jié)果的影響，見表3。

表3 耐用性試驗結(jié)果Tab 3 Results of durability test

結(jié)果顯示，雜質(zhì)Ⅰ與雜質(zhì)Ⅱ的相對保留時間比較穩(wěn)定，雜質(zhì)Ⅱ與環(huán)戊丙酸雌二醇的分離良好。計算得雜質(zhì)Ⅰ的相對響應(yīng)因子為0.9～1.0，雜質(zhì)Ⅱ的相對響應(yīng)因子為0.3～0.4，受參數(shù)變化影響較小。擬定標(biāo)準(zhǔn)雜質(zhì)Ⅰ按不加校正因子的主成分自身對照法計算，以相對主峰的保留時間進(jìn)行定性；雜質(zhì)Ⅱ采用雜質(zhì)對照品外標(biāo)法進(jìn)行定量（與加校正因子主成分自身對照法計算的結(jié)果一致，見“2.11”項）。

2.7 精密度試驗

分別取“2.5”項下環(huán)戊丙酸雌二醇（1.0 μg/ml）、雜質(zhì)Ⅱ（2.0 μg/ml）對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，環(huán)戊丙酸雌二醇、雜質(zhì)Ⅱ峰面積變化的RSD分別為0.1%、0.4%（n＝6）。

取供試品溶液（批號:20110941）連續(xù)進(jìn)樣6次，峰面積的RSD為0.2%（n＝6）。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液（批號:20110941）放置0、8、16、24 h時取樣測定，峰面積的RSD為0.5%（n＝4）。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 雜質(zhì)Ⅱ測定的準(zhǔn)確度試驗

分別精密稱取環(huán)戊丙酸雌二醇原料藥（批號:20110941）9份，每份100 mg，置于100 ml量瓶中，精密加入雜質(zhì)Ⅱ?qū)φ掌焚A備液（20 μg/ml）4、5、6 ml，加溶劑溶解并稀釋至刻度，測定高、中、低3種質(zhì)量濃度的回收率，結(jié)果平均值分別為98.86%、99.92%、100.07%，總平均回收率為99.62%，RSD為0.6%（n＝9）。

2.10 雜質(zhì)檢測限與定量限試驗

取“2.5”項下溶液適量，采用逐步稀釋法稀釋，當(dāng)信噪比為3時，雜質(zhì)Ⅰ、雜質(zhì)Ⅱ與環(huán)戊丙酸雌二醇檢測限分別為6.3、1.5、2.3 ng；當(dāng)信噪比為10時，雜質(zhì)Ⅰ、雜質(zhì)Ⅱ與環(huán)戊丙酸雌二醇定量限分別為21.0、5.0、7.7 ng。

2.11 樣品中有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果

量取“2.2”項下供試品溶液、對照溶液、對照品溶液各50 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主峰保留時間的3倍，供試品溶液如有與雜質(zhì)Ⅱ保留時間一致的色譜峰，按外標(biāo)法以峰面積計算，不得過0.2%；在相對保留時間為0.7處如有雜質(zhì)峰（雜質(zhì)Ⅰ），不得大于對照溶液主峰峰面積的1.5倍（0.15%）；其他單個雜質(zhì)不得大于對照溶液主峰峰面積（0.1%），雜質(zhì)總量不得過1.0%。供試品溶液中任何小于對照溶液主峰面積0.1倍的峰可忽略不計。3批樣品有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果見表4。

表4 3批樣品有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果（%）Tab 4 Results of related substances in 3 batches of samples（%）

3 討論

（1）本試驗中取系統(tǒng)適用性試驗溶液進(jìn)樣，用二極管陣列檢測器（DAD）檢測，環(huán)戊丙酸雌二醇、雜質(zhì)Ⅰ及單個雜質(zhì)的最大吸收波長為280 nm，雜質(zhì)Ⅱ的最大吸收波長為263 nm。擬定標(biāo)準(zhǔn)采用280 nm作為檢測波長。由于雜質(zhì)Ⅰ與雜質(zhì)Ⅱ的相對保留時間重現(xiàn)性較好，雜質(zhì)Ⅰ與雜質(zhì)Ⅱ的相對響應(yīng)因子受參數(shù)變化影響較小，故雜質(zhì)Ⅰ按不加校正因子的主成分自身對照法計算，以相對主峰的保留時間進(jìn)行定性。雜質(zhì)Ⅱ采用加校正因子的主成分自身對照法與外標(biāo)法計算的結(jié)果一致，由于雜質(zhì)Ⅱ易于獲得，且經(jīng)結(jié)構(gòu)確證且純度大于98.5%，故擬定標(biāo)準(zhǔn)采用雜質(zhì)對照品外標(biāo)法進(jìn)行定量。

（2）筆者曾采用梯度洗脫的方式進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢查，由于不同的儀器間梯度準(zhǔn)確度的差異會導(dǎo)致分離重現(xiàn)性差；而等度洗脫的方式重現(xiàn)性較好，各有關(guān)物質(zhì)間的分離度均＞2.0，有關(guān)物質(zhì)的定量準(zhǔn)確度也不受影響，因此本試驗最終采用等度洗脫的方式。

（3）環(huán)戊丙酸雌二醇是以雌酚酮與環(huán)戊丙酰氯為起始原料，通過一系列酯化及水解后的終產(chǎn)物。環(huán)戊丙酰氯中含有微量環(huán)戊乙酰氯，與雌酚酮的反應(yīng)副產(chǎn)物為雜質(zhì)Ⅰ，雜質(zhì)Ⅱ為雌酚酮脫氫物（雌酚酮及雌激素衍生物的合成中使用二氯二氰基苯醌脫氫[4]）與環(huán)戊丙酰氯的反應(yīng)副產(chǎn)物。試驗發(fā)現(xiàn)3批樣品中均檢出雜質(zhì)Ⅰ、雜質(zhì)Ⅱ，但未檢出另一已知雜質(zhì)雌二醇。

[1]雷貞武.新的激素避孕方法:Lunella注射避孕針[J].國際生殖健康/計劃生育雜志，2008，27（1）:58.

[2]唐彥，朱珠.月用避孕藥:復(fù)方甲羥孕酮[J].中國藥學(xué)雜志，2001，36（11）:285.

[3]The United States Pharmacopeial Convention.U.S.Pharmacopeia（36）-National Formulary（31）[S].Baltimore:United Book Press，Inc.，2013:3480.

[4]景羽.雌酚酮及雌激素衍生物的合成研究[D].上海:上海師范大學(xué)，2010:1-93.