穆曉琨, 字向東, 畢琳

(1.肇慶學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院, 廣東 肇慶 526061; 2.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 四川 成都 610041;3.犍為縣畜牧局, 四川 犍為 614400)

牦牛INHBA基因的克隆及序列分析

穆曉琨1, 字向東2, 畢琳3

(1.肇慶學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院, 廣東 肇慶 526061; 2.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 四川 成都 610041;3.犍為縣畜牧局, 四川 犍為 614400)

根據(jù)GenBank檢索到的普通牛的INHBA基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物, 以牦牛卵巢組織總RNA為模板, 通過(guò)RT-PCR技術(shù)對(duì)牦牛INHBAcDNA進(jìn)行克隆測(cè)序和序列分析.結(jié)果表明: 擴(kuò)增片段1360bp, 包含1277bp的編碼區(qū), 編碼426個(gè)氨基酸.與普通牛相比, 牦牛INHBA基因編碼區(qū)存在2處堿基轉(zhuǎn)化.牦牛與普通牛、綿羊、人、鼠和豬的核苷酸序列同源性分別為99.84%、97.97%、91.41%、87.79%、91.94%, 氨基酸序列同源性分別為99.53%、98.82%、95.77%、93.88%、93.88%.蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析顯示,INHBA蛋白不易形成α螺旋和跨膜結(jié)構(gòu), 是相對(duì)保守的疏水性蛋白.

牦牛;INHBA;克隆; 序列分析

抑制素是一種主要由雄性睪丸支持細(xì)胞[1]和雌性卵巢顆粒細(xì)胞分泌[2]的二聚體糖蛋白激素.抑制素屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)超家族成員, 該家族成員主要參與體內(nèi)各種影響細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的功能[3-5].抑制素主要有INHA、INHBA和INHBB三種類型的亞基.INHA亞基上具有糖基化位點(diǎn),INHA亞基分別與INHBA和INHBB亞基之間通過(guò)二硫鍵連接而成異質(zhì)二聚體[6], 即抑制素A(αβA)和抑制素B(αβB).許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)抑制素可以抑制FSH在垂體中的分泌[7-11], 是哺乳動(dòng)物FSH分泌的主要負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子.抑制素的水平能反映出發(fā)情周期中卵泡生長(zhǎng)的數(shù)量, 是決定動(dòng)物排卵的關(guān)鍵調(diào)節(jié)激素[12].

牦牛是青藏高原的一個(gè)特有畜種, 分布于海拔 3000m以上, 能適應(yīng)高寒、低氧等極端生態(tài)條件[13], 是青藏高原畜牧業(yè)的支柱, 在遺傳資源上是一個(gè)極為寶貴的基因庫(kù)[14].然而牦牛的繁殖性能相對(duì)低下, 在如何提高牦牛繁殖形狀的課題上, 國(guó)內(nèi)外進(jìn)行了大量的科學(xué)研究.本研究對(duì)牦牛INHBA基因編碼區(qū)進(jìn)行克隆分析, 并通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)其蛋白進(jìn)行功能和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè), 以期為牦牛INHBA基因的表達(dá)調(diào)控和繁殖性狀的相關(guān)分析提供一定的理論基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 材料

從成都近郊的屠宰場(chǎng)采集剛屠宰的牦牛卵巢, 液氮凍存.pMD 18-T Vector、Taq DNA聚合酶、DL2000 Marker均為T(mén)akara產(chǎn)品; 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermantas(MBI)公司; OMEGA膠回收試劑盒、大腸桿菌DH5α均購(gòu)于天根生化科技有限公司.

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank收錄的牛INHBA基因 mRNA序列(登錄號(hào)NM_ 74363), 利用primer5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物,序列為: F 5'ACACAACAACTTTTGCTGCC 3', R 5'TCGTGTCACCACTGTCTTCTC 3', 擴(kuò)增長(zhǎng)度為1360bp, 由上海英駿公司合成.

1.2.2 總RNA的提取和RT-PCR

采用Trizol法提取牦牛卵巢組織總RNA, 使用Fermentas(MBI)反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄, 合成cDNA第一鏈.以該cDNA鏈為模板進(jìn)行PCR, 反應(yīng)體系25ul: 10×loading buffer 2.5μL, dNTPs(10mmol/L)2μL, cDNA 1μL, 15 umol/L 的上下游引物各1 μL, Taq酶0.3μL, 17.2 μL ddH2O.PCR反應(yīng)體系: 95℃ 預(yù)變性4 min; 94℃變性 30s;56℃退火30s; 72℃延伸1min30s; 共32個(gè)循環(huán); 最后72℃終延伸7 min; 4℃保存.產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè).

1.2.3 PCR產(chǎn)物的克隆、鑒定及測(cè)序

將純化后的PCR產(chǎn)物與pMD 18-T載體16℃下連接過(guò)夜后, 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α中, 涂布含Amp、X-gal和IPTG的LB平板上, 37℃過(guò)夜培養(yǎng).挑選白色菌落接種于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中, 37℃, 200r/min振蕩過(guò)夜培養(yǎng).菌液PCR鑒定后, 送上海英駿測(cè)序.

1.2.4 INHBA基因的生物信息學(xué)分析

將擴(kuò)增得到的牦牛INHBA基因序列與 GenBank中檢索到的牛(NM_174363)、綿羊(NM_001009458.1)、人(NM_002192.2)、鼠(NM_008380.1)和豬(NM_214028.1)的基因序列通過(guò) DNAMAN 軟件進(jìn)行序列比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建.利用相關(guān)在線蛋白分析軟件對(duì)INHBA蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)、疏水性及跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、信號(hào)肽預(yù)測(cè)(SignalP 4.0)等功能分析和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè).

2 結(jié)果與分析

2.1 INHBA基因的克隆

參照牛INHBA基因 mRNA序列設(shè)計(jì)的引物, 以牦牛總cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 得到一條特異性條帶(圖1), 測(cè)序結(jié)果顯示該片段長(zhǎng)為1360bp, 其中編碼區(qū)全長(zhǎng)1277bp, 共編碼426個(gè)氨基酸, 堿基含量分析顯示A、C、G和T的含量分別為25%、25.4%、31.3%和18.2%.

圖1 牦牛INHBA基因RT-PCR產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果

2.2 序列比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

將測(cè)序得到的牦牛INHBA基因序列與參照序列牛的INHBA基因序列進(jìn)行序列比對(duì), 結(jié)果顯示: 2者編碼區(qū)序列長(zhǎng)度一致, 但存在2個(gè)堿基差異(圖2): 53位T→C, 導(dǎo)致氨基酸由纈氨酸變?yōu)楸彼?Val→Ala); 762位G→A,導(dǎo)致氨基酸由纈氨酸變?yōu)榧琢虬彼?Val→Met).

通過(guò)DNMMAN軟件比對(duì)后, 發(fā)現(xiàn)牦牛INHBA基因的核苷酸序列與普通牛、綿羊、人、鼠和豬的同源性分別為99.84%、97.97%、91.41%、87.79%和91.94%, 氨基酸序列同源性分別為99.53%、98.82%、95.77%、93.88%和93.88%, 同時(shí)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn), 牦牛與牛親緣關(guān)系最近, 綿羊次之(圖3).

圖2 牦牛與牛INHBA基因編碼區(qū)序列比對(duì)結(jié)果

圖3 不同物種INHBA基因進(jìn)化樹(shù)分析

2.3 牦牛INHBA蛋白質(zhì)功能分析和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.3.1 理化性質(zhì)分析

利用在線蛋白分析軟件(http://www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl)中ProtParam程序分析牦牛INHBA蛋白質(zhì)的基本性質(zhì).牦牛INHBA蛋白分子量為102661.5 Da, 等電點(diǎn)PI﹦4.99, 該蛋白質(zhì)不含任何Trp殘基, 其不穩(wěn)定指數(shù)為45.45(不穩(wěn)定系數(shù)>40為不穩(wěn)定蛋白, 不穩(wěn)定系數(shù)<40為穩(wěn)定蛋白), 屬于不穩(wěn)定蛋白, 脂質(zhì)指數(shù)為25.04,Hydropathicity (GRAVY)為0.834, 表現(xiàn)為疏水性, 屬結(jié)構(gòu)蛋白.

2.3.2 疏水性及跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用Expasy在線分析軟件ProtScale程序?qū)﹃笈NHBA基因疏水性進(jìn)行分析(圖略).該蛋白質(zhì)的疏水性最小值為-0.633, 最大值為 2.422, 不易形成 α螺旋和跨膜結(jié)構(gòu), 屬于具有疏水性蛋白.利用在線分析軟件TMHMM-2.0、TMPRED預(yù)測(cè)結(jié)果表明, 牦牛INHBA無(wú)跨膜結(jié)構(gòu), 僅具有2個(gè)較高可能性的跨膜區(qū).

2.3.3 亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

使用POSRTⅡ在線分析程序, 發(fā)現(xiàn)牦牛的INHBA蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)(52.2%)和細(xì)胞核(21.7%),但在分泌系統(tǒng)囊泡(4.3%)、細(xì)胞骨架(4.3%)、液泡(4.3%)、高爾基體(4.3%)、線粒體(4.3%)和過(guò)氧化物酶體(4.3%)等細(xì)胞器中也有少量分布.分別用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型和隱馬爾可夫模型進(jìn)行蛋白核定位信號(hào)分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNES/), 發(fā)現(xiàn)牦牛的INHBA蛋白無(wú)潛在的核定位信號(hào)結(jié)構(gòu)特征.

2.3.4 磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

用NetPhos 2.0 Server在線磷酸化分析軟件對(duì)牦牛INHBA進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)分析, 發(fā)現(xiàn)牦牛該蛋白存在11個(gè)磷酸化位點(diǎn), 分別位于27、76、114、298、420、421、527、613、726、985、1195 bp處, 僅存在蘇氨酸(Thr)中.

2.3.5 信號(hào)肽及CpG島預(yù)測(cè)

利用在線 SignalP 4.0 Server 程序進(jìn)行蛋白質(zhì)序列的信號(hào)肽預(yù)測(cè), 其中C 值代表切割位點(diǎn)分值、Y 值代表從C 與Y 值衍生的切割位點(diǎn)預(yù)測(cè)分值, S 值代表氨基酸的位置.當(dāng)SP(signal peptide)為“YES”, 表示存在信號(hào)肽,SP為“NO”, 表示不存在信號(hào)肽.牦牛INHBA蛋白不存在信號(hào)肽.在線生物軟件CpG Island Searcher 預(yù)測(cè)CpG島, 發(fā)現(xiàn)牦牛INHBA蛋白中存在一個(gè)CpG島, 在核苷酸序列中起始于3 bp處, 結(jié)束于587 bp處, 長(zhǎng)585 bp, 其中GC含量為56.4%, ExpCpG值為0.652.

2.3.6 保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

通常蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)中包含著許多功能結(jié)構(gòu)域, 不同的功能結(jié)構(gòu)域各司其職決定著該蛋白的特殊功能.通過(guò)對(duì)保守功能結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè), 推測(cè)出蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能.利用NCBI在線CDD v 3.10分析軟件對(duì)牦牛INHBA蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)(圖4).INHBA氨基酸90～725位是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β肽, 此肽被稱為延遲關(guān)聯(lián)肽(LAP)的TGF-β, 其中LAP是二硫化物連接到TGF-β結(jié)合蛋白上形成的一種同型二聚體; 同時(shí)在960～1278位是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)超家族, 家庭成員作為二硫鍵連接的同源或異源二聚體發(fā)揮功能.TGFB是一種多功能的肽,其控制細(xì)胞增殖, 分化, 并且在不同細(xì)胞類型中功能各異.

圖4 INHBA蛋白的保守結(jié)構(gòu)域

2.3.7 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過(guò)HNN在線分析軟件對(duì)牦牛INHBA蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)(圖5).該蛋白有109個(gè)α螺旋(Alpha helix Hh),占全結(jié)構(gòu)的25.65%; 延伸鏈(Extended strand Ee)有77個(gè), 占全結(jié)構(gòu)的18.12%; 16個(gè)β轉(zhuǎn)角(Beta turn, 3.76%); 無(wú)規(guī)則卷曲(Random coil Cc)有223處, 占全結(jié)構(gòu)的52.47%.

圖5 INHBA蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

3 討論

作為影響動(dòng)物繁殖性狀的候選基因, 抑制素基因在綿羊[15]、牛[16]、豬[17]、人[18]和鼠[19]上的結(jié)構(gòu)已經(jīng)闡明, 本文首次克隆了牦牛INHBA基因, 其中編碼區(qū)長(zhǎng)為1277bp, 編碼426個(gè)氨基酸, 通過(guò)與其他物種的進(jìn)行比對(duì), 牦牛與普通牛和綿羊的核苷酸和氨基酸序列的同源性皆高達(dá)95%以上, 對(duì)牦牛INHBA蛋白進(jìn)行功能分析和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè), 顯示該蛋白也表明INHBA主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核, 無(wú)跨膜結(jié)構(gòu).

由于抑制素對(duì)FSH分泌具有反饋抑制作用, 所以利用抑制素免疫可以不同程度的提高牛、綿羊、豬等的排卵率和受精率, 而其中INHBA基因?qū)?dòng)物的繁殖性能的影響主要集中在羊的研究上.Leyhe[20]發(fā)現(xiàn)綿羊INHBA基因座Taq IA等位基因頻率與綿羊品種平均產(chǎn)羔數(shù)呈正相關(guān), Hiendleder通過(guò)391只Merinolandschafe母羊1585窩產(chǎn)羔數(shù)的動(dòng)物模型分析證實(shí)了INHBA基因?qū)d羊的產(chǎn)羔數(shù)有顯著影響[21].莊海濱對(duì)綿羊抑制素INHBA基因的研究中證明,INHBA基因上存在多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn), 且其中有的基因位點(diǎn)對(duì)綿羊的產(chǎn)羔數(shù)具有影響作用[22].彭志蘭在對(duì)濟(jì)寧青山羊的研究中也同樣證明,INHBA基因?qū)υ撋窖虍a(chǎn)羔數(shù)具有影響[23].目前牦牛上INHBA基因的研究較少,INHBA基因在牦牛上是否存在多態(tài)性并未被證實(shí), 通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)牦牛與綿羊的同源性高達(dá)97.97%, 而INHBA基因多態(tài)性對(duì)綿羊繁殖性狀的影響是否適用于牦牛有待進(jìn)一步研究.

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Molecular cloning and sequence analysis of theINHBAgene in yak (Bos grunniens)

MU Xiao-kun1, ZI Xiang-dong2, BI Lin3

(1.Biology Department, Zhaoqing College, Zhaoqing 526061, P.R.C.; 2.College of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, P.R.C.; 3.Qianwei County Animal Husbandry Bureau, Qianwei 614400, P.R.C.)

The specific primers were designed according to reference sequence of Bos taurus in GenBank.Using the total RNA extracted from yak ovarian tissue as template, cDNA sequence ofINHBAgene of yak was cloned by RT-PCR and then the sequence was analyzed.The results demonstrated that 1360bp was cloned, with the coding region of 1277bp encoding 426 amino acids.There were two different bases between Bos taurus and Bos grunniens in the coding region.Nucleotide sequence similarities of theINHBAgene in Bos grunniens are compared with Bos taurus, Ovis aries, Homo sapiens, Mus musculus, Sus scrofa were 99.84%, 97.97%, 91.41%, 87.79%, and 91.94%, respectively, and the amino acid sequence similarities of theINHBAprotein in Bos grunniens were 99.53%, 98.82%, 95.77%, 93.88%, and 93.88% respectively.Structural analysis of protein demonstrated that theINHBAprotein which was difficult to form Alpha helix and Membrane structure, was relatively conservative hydrophobic proteins.

Bos grunniens;INHBA; cloning; sequence analysis

S823

A

1003-4271(2014)02-0173-06

10.3969/j.issn.1003-4271.2014.02.03

2013-12-21

穆曉琨(1988-), 男, 助教, 碩士, 研究方向: 遺傳學(xué); E-mail:x_laws@126.com.

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào): 12NZYTH07).