白 莉，賈永平，忽海洋

無論是否伴有糖尿?。―M），急性心肌梗死（AMI）發(fā)病早期血糖水平升高都很常見。在ST 段抬高AMI（STEMI）患者中，應激性高血糖（acute hyperglycemia，SHG）發(fā)生率可高達50%［1］，而 之 前 診 斷 為DM 的 患 者 僅 占20%～25%［2］，一 項Meta分析結(jié)果表明，AMI時SHG 與患者病死率密切相關(guān)［3］，入院血糖已成為院內(nèi)充血性心力衰竭（CHF）和死亡的主要獨立預測因子［4］。同時眾多大型臨床研究結(jié)果表明AMI患者合并高血糖時，即使接受抗凝藥物、溶栓藥物和早期冠脈介入治療恢復血流灌注，其冠脈微循環(huán)障礙、心源性休克和猝死等并發(fā)癥的發(fā)生率均較血糖水平正常的AMI患者顯著增加，而SHG 對機體發(fā)生心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia／reperfusion injury，MIRI）時缺血期和再灌注期不同時期的影響及機制，有待進一步研究。本研究采用成年大鼠結(jié)扎冠狀動脈前降支制作心肌缺血／再灌注模型［5］，分別于缺血期和再灌注期靜脈輸注高糖觀察心肌細胞的損傷程度和心肌梗死面積（IS）變化，進而探討心肌缺血再灌注不同時期SHG 發(fā)生與MIRI之間的關(guān)系及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物及試劑 健康成年SD 大鼠（北京實驗動物中心提供）50只，2月～3月齡，體重250g～300g，正常飲食。乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；微量注射泵（美國Harvard公司）；HX－200動物呼吸機（成都太萌科技有限公司）；血糖儀（德國羅氏公司）；Evans藍和氯化三苯基四氮唑（TTc，Sigma公司）。

1.2 MIRI的模型建立 取實驗大鼠稱重，以30g／L戊巴比妥鈉（30mg／kg）腹腔注射麻醉，仰臥固定于鼠臺，分離頸靜脈以建立靜脈通路，以程控微量注藥泵輸液給藥。行氣管切開，氣管插管行呼吸機輔助呼吸（呼吸頻率60 次／min，潮氣量20mL／kg，吸呼比1∶2），四肢皮下插入針形電極描記心電圖，沿胸骨左緣第3、4肋間行縱向切口，在左冠狀動脈前降支起始部2mm 處，用6.0 絲線穿過心肌淺層，結(jié)扎阻斷冠脈血流造成心肌缺血，30min后放松聚乙烯管和絲線，以造成再灌注模型。以心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST 段抬高為缺血模型形成，放松后抬高的ST 段下降1／2以上為MIRI造模成功。缺血30min，再灌注3h，再灌注開始后封閉胸腔（排凈胸腔氣體），恢復動物自主呼吸。

1.3 實驗分組 將大鼠隨機分為假手術(shù)組（SHAM）、高糖組（HG）、生理鹽水對照組（CON）、缺血期高糖組（HGI）、再灌注期高糖組（HGR），每組10只。假手術(shù)組和HGI組、HG 組只在左冠狀動脈前降支下穿線不結(jié)扎。HG 組：開始后一次性給予500 g／L葡萄糖1mL 靜脈內(nèi)注射，繼而500g／L 高糖靜脈內(nèi)泵入，持續(xù)3.5h；CON 組：缺血開始后一次性給予生理鹽水1mL 靜脈內(nèi)注射，繼而持續(xù)靜脈內(nèi)泵入，至再灌注結(jié)束；HGI組：缺血開始后一次性給予500g／L葡萄糖1mL靜脈內(nèi)注射，繼而給予500g／L葡萄糖持續(xù)靜脈內(nèi)泵入，再灌注開始后給予生理鹽水靜脈內(nèi)泵入直至再灌注結(jié)束；HGR 組：缺血開始后給予生理鹽水靜脈輸注，再灌注開始后一次性給予500g／L葡萄糖1mL靜脈注射，繼而給予500g／L葡萄糖持續(xù)靜脈內(nèi)泵入，至再灌注結(jié)束。各組靜脈輸液速度均為4mL／（kg·h）。

1.4 檢測指標 分別于缺血前、缺血后25min、再灌注1.5h和3h從尾靜脈取血，用血糖儀測血糖水平。再灌注結(jié)束后，打開腹腔，由腹主動脈取血3mL，常溫放置2 0min后，3 0 0 0 r／min，離心5min，取血清300μL進行檢測。嚴格按照試劑盒說明書進行操作檢測LDH 水平。

1.5 伊文氏藍－TTC雙染法測定IS 再灌注3h結(jié)束后再次原位阻斷冠狀動脈血流，2%伊文氏藍4mL 由頸動脈注入后迅速分布全身，迅速將心臟剪下，4 ℃生理鹽水清洗后凍存于－20℃冰箱。1h后用心臟切片器垂直于心臟長軸將其切成1 mm厚的薄片，置于1%TTC（pH 7.4）溶液中，37 ℃孵育15min后置于4%的甲醛溶液過夜。次日，將已染色的心肌薄片按順序放置于平板上，用配備有微焦距鏡頭的數(shù)碼相機拍照，并輸入計算機。采用單盲法分別將伊文藍染色區(qū)（藍染，非缺血區(qū)）、TTC染色區(qū)（紅染，缺血區(qū)）以及非TTC染色區(qū)（白色，梗死區(qū)）用Image Pro Plus面積測算軟件進行計算處理。總?cè)毖娣e以缺血區(qū)面積（AAR）占左室（LV）面積百分比表示（AAR／LV×100%），IS以心臟梗死范圍（INF）占缺血區(qū)面積（AAR）的百分比表示（INF／AAR×100%）。

1.6 統(tǒng)計學處理 以SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用One－Way ANOVA 分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠心肌缺血再灌注模型的制備 本實驗采用戊巴比妥腹腔麻醉效果好，輔以合適的呼吸參數(shù)及穩(wěn)定的呼吸機性能，術(shù)中呼吸道分泌物少，無麻醉意外發(fā)生?？傆?0 只大鼠，SHAM組及HG 組大鼠全部存活，CON 組大鼠死亡1 只，HGI組大鼠死亡3只，HGR 組大鼠死亡2 只，死亡的原因主要是嚴重的心律失常、分泌物呼吸道梗阻等。

2.2 各組血糖水平變化 缺血前各組間血糖水平差異無統(tǒng)計學意義；CON 組在缺血期血糖水平均略有降低，再灌注期血糖水平均略有升高，但兩者之間差異無統(tǒng)計學意義。靜脈輸注高糖后，血糖水平迅速升高，與CON 組相比，HGI組缺血期血糖水平顯著升高（P＜0.05），再灌注期血糖水平逐漸下降。與CON 組相比，HGR 組再灌注期血糖水平顯著升高（P＜0.05）。詳見表1。

表1 不同時間點各組的血糖水平mmol／L

表1 不同時間點各組的血糖水平mmol／L

與SHAM 組相比，1）P＜0.01；與CON 組相比，2）P＜0.01。

組別 缺血前 缺血25min 再灌注1.5h 再灌注3h SHAN 組5.1±0.7 4.9±0.6 5.2±0.4 5.3±0.4 HG 組 5.0±0.5 11.3±0.91） 11.1±0.61） 11.2±0.41）CON 組 4.9±0.4 4.8±0.3 4.9±0.2 5.1±0.3 HGI組 4.6±0.5 18.1±0.91）2） 8.7±0.61）2） 6.5±0.41）2）HGR 組 5.3±0.5 5.0±0.4 18.4±0.81）2） 19.1±0.71）2）

2.3 心肌酶譜檢測結(jié)果 HG 組與SHAM 組相比，差異無統(tǒng)計學意義；MIRI各組LDH 水平顯著高于SHAM 組，其中CON 組 是SHAM 組 的2.65 倍，HGI 組、HGR 組 分 別 為SHAM 組的3.41倍和2.81倍；與CON 組相比，HGI組LDH水平為1.29倍，差異有統(tǒng)計學意義，而HGR 組與CON 組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見表2。

表2 不同處理組大鼠血清LDH 水平比較U／L

表2 不同處理組大鼠血清LDH 水平比較U／L

與SHAM 組相比，1）P＜0.01；與CON 組相比，2）P＜0.05，3）P＜0.01。

2.4 不同處理組大鼠MIRI后IS比較 應激性高血糖可加重心肌細胞凋亡，擴大心肌梗死面積。CON 組、HGI組和HGR組間總?cè)毖秶町悷o統(tǒng)計學意義。大鼠發(fā)生MIRI時心臟出現(xiàn)明顯的梗死區(qū)。與CON 組相比，HGI組的IS 明顯擴大，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而HGR 組IS與CON 組相比略增大，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見表3。

表3 不同處理組大鼠MIRI后IS比較 %

表3 不同處理組大鼠MIRI后IS比較 %

與CON 組相比，2）P＜0.01。

組別IS CON 組36.53±3.06 HGI組 46.93±3.521）HGR 組 38.50±2.71

3 討 論

大量臨床研究發(fā)現(xiàn)，無論患者既往有無糖尿病，只要AMI時合并有高血糖存在，即使溶栓、介入等技術(shù)手段可以及時疏通閉塞血管實現(xiàn)缺血心肌的再灌注，心力衰竭及死亡的發(fā)生率依然顯著高于正常血糖患者［6］。Lavi等［7］研究證實，STEMI患者即使接受PCI治療，其入院血糖水平和院內(nèi)死亡率呈顯著正相關(guān)，急性高血糖仍是預后不佳的強烈預測因子。而發(fā)生急性高血糖的患者中，只有20%～25%既往有糖尿病史，這顯然不能完全靠糖尿病引起動脈粥樣硬化程度加重來解釋，高血糖可能直接增加了心肌自身對MIRI的敏感性，導致?lián)p傷加重。目前研究普遍認為，AMI并發(fā)SHG 的主要機制是機體的應激反應致神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的全面激活及存在潛在的糖代謝紊亂［8］。

當細胞受損后，細胞內(nèi)的LDH 漏出到細胞外，因此本實驗通過測定血清中LDH 活性反映心肌細胞損傷的程度，同時采用伊文氏藍－TTC雙染法測定心肌梗死面積以明確不同時期的高血糖是否增加MIRI。在實驗中，與SHAM 組相比，HG 組LDH 水平升高不明顯，而行MIRI各組大鼠LDH 水平明顯升高，IS擴大，其中HGI大鼠的LDH 活性最高，IS最大，HGR 組的LDH 水平及IS與CON 組比較差異統(tǒng)計學意義。這說明單獨高糖刺激并不能引起心肌細胞的明顯損傷，靜脈輸注高糖后，AMI大鼠心肌對MIRI的敏感性升高，缺血期的高血糖會造成更嚴重的心肌損傷。提示缺血期和再灌注期高血糖對心肌細胞損傷的影響或機體對抗應激的機制和反應過程不同。已有大量實驗證明快速血糖升高會產(chǎn)生強烈的氧化應激反應［9］。而急性高血糖和MIRI可以通過線粒體誘發(fā)活性氧（ROS）的爆發(fā)性產(chǎn)生，過度的ROS生成觸發(fā)不同的細胞功能障礙，包括脂質(zhì)過氧化，DNA 突變，及細胞凋亡或壞死［10］，當ROS的產(chǎn)生超過機體的清除能力，會導致細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)失衡，致細胞凋亡增加。推測缺血期SHG 誘發(fā)的增強的氧化應激可能會影響心肌細胞的氧化還原狀態(tài)，進而削弱其抗氧化抗凋亡功能，造成更嚴重的心肌損傷。同時，高血糖可加重炎癥反應，致血管內(nèi)皮功能紊亂，引起內(nèi)皮依賴性血管舒張功能減退及內(nèi)皮細胞凋亡［11］。心肌梗死大小更多地取決于細胞凋亡的嚴重程度，隨著缺血期血糖升高，心肌細胞缺血、缺氧加重，致使再灌注期冠脈微循環(huán)障礙發(fā)生率更高，并發(fā)致死性心律失常的幾率明顯增加［12］，表現(xiàn)為實驗中HGI組IS進一步擴大，并有3只大鼠死于惡性心律失常。

本研究發(fā)現(xiàn)缺血期高血糖可以增加大鼠心肌對MIRI的易感性而加重MIRI，這可能與高糖誘發(fā)的氧化應激效應加重MIRI大鼠活性氧的產(chǎn)生、高凝狀態(tài)、內(nèi)皮功能不全，以及加重炎癥反應，致心肌氧化還原失衡等有關(guān)，進而影響冠脈舒張，加重再灌注期微循環(huán)障礙，使凋亡加重。但本實驗未探討MIRI發(fā)生SHG 時機體的抗氧劑系統(tǒng)的活性以及應對氧化應激的機制，從而在臨床上可以有針對性地采取干預措施，降低SHG 對MIRI的危害，改善預后。

［1］ Norhammar A，Tenerz A，Nilsson G，et al.Glucose metabolism in patients with acute myocardial infarction and rio previous diagnosis of diabetes mellitus：A prospective study［J］.Lancet，2002，359（9324）：2140－2144.

［2］ Wahab NN，Cowden EA，Pearce NJ，et al.Is blood glucose an independent predictor of mortality in acute myocardial infarction in the thrombolytic era［J］.J Am Coll Cardiol，2002，40（10）：1748－1754.

［3］ McCowen KC，Malhotra A，Bistrian BR.Stress－induced hyperglycemia［J］.Crit Care Clin，2001，17（1）：107－124.

［4］ Zeller M，Steg P，Ravisy J，et al.Prevalence and impact of metabolic syndrome on hospital outcomes in acute myocardial infraction［J］.Arch Intern Med，2005，65（10）：1192－1198.

［5］ 衛(wèi)洪超，和庚戌，胡勝壽，等.建立一種標準化急性心肌梗死動物模型［J］.中華實驗外科雜志，2005，22：876－878.

［6］ Capes SE，Hunt D，Malmberg K，et al.Stress hyperglycaemia and increased risk of death after myocardial infarction in patients with and without diabetes：A systematic overview［J］.Lancet，2000，355（9206）：773－778.

［7］ Lavi S，Kapeliovich M，Gruberg L，et al.Hyperglycemia during acute myocardial infarction in patients who are treated by primary percutaneous coronary intervention：Impact on long－term prognosis［J］.Int J Cardiol，2008，123（2）：117－122.

［8］ Begieneman MP，van de Goot FR，Krijnen PA，et al.The basement membrane of intracardial capillaries is thickened in patients with acute myocardial infarction［J］.J Vasc Res，2010，47（1）：124－125.

［9］ Monnier L，Mas E，Ginet C，et al.Activation of oxidative stress by acute glucose fluctuations compared with sustained chronic hyperlycemia in patients with type 2diabetes［J］.JAMA，2006，29（14）：1681－1687.

［10］ Takimoto E，Kass DA.Role of oxidative stress in cardiac hypertrophy and remodeling［J］.Hypertension，2007，49：241－248.

［11］ Kawano H，Motoyama T，Hirashima O，et al.Hyperglycemia rapidly suppresses flow－mediated endothelium－dependent vasodilation of brachial artery［J］.J Am Coil Cardiol，1999，34（1）：146－154.

［12］ Heineke J，Kempf T，Kraft Tet al.Downregulation of cytoskeletal muscle LIM protein by nitric oxide：Impact on cardiac myocyte hypertrophy［J］.Circulation，2003，107（10）：1424－1432.