李詩卉　 劉榕焱　 葉琦等

灘涂適生金銀花組培體系的構(gòu)建與優(yōu)化

李詩卉， 劉榕焱， 葉 琦， 李 梅， 王長海， 趙耕毛*（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院江蘇省海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210095）

摘要 [目的]構(gòu)建并優(yōu)化灘涂適生金銀花的組培體系。[方法]以具有活力的金銀花莖段、葉芽和葉片為材料，采用混合水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以MS為基本培養(yǎng)基，與不同濃度比例的NAA、IBA、6BA、KT等植物生長調(diào)節(jié)劑構(gòu)成金銀花誘導(dǎo)愈傷組織、叢芽分化、生根的組合方案，對(duì)金銀花組織培養(yǎng)快繁技術(shù)開展系統(tǒng)研究。[結(jié)果]外植體類型影響愈傷組織的產(chǎn)生，葉芽的愈傷組織誘導(dǎo)分化率顯著高于莖段和葉片（P<0.05），誘導(dǎo)出的愈傷組織結(jié)構(gòu)緊密。不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合的培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)率也有顯著影響（P<0.05）。愈傷組織在培養(yǎng)基MS+0.05 mg/L 6BA+1.0 mg/L NAA中生長良好，具備較高的分化能力。含有低濃度的生長素和分裂素的培養(yǎng)基MS+0.1 mg/L 6BA+0.05 mg/L NAA更有利于金銀花愈傷組織誘導(dǎo)叢芽分化，能夠從數(shù)量和質(zhì)量上改善分化出的叢芽素質(zhì)。在誘導(dǎo)根分化的培養(yǎng)基MS+0.03 mg/L NAA+1.00 mg/L IBA中，根的分化效率明顯提高，叢根更為密集，有利于擴(kuò)大繁殖系數(shù)。[結(jié)論]試驗(yàn)為金銀花提供了從“外植體選擇→誘導(dǎo)愈傷組織→叢芽分化→生根”等整個(gè)過程中優(yōu)化的組培快繁體系，為耐鹽金銀花灘涂規(guī)?；N植提供了技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞 金銀花（FLOS LONICERAE JAPONICAE）；組織培養(yǎng)；愈傷組織；正交試驗(yàn)

中圖分類號(hào) S567.7+9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）08-02282-04

The Construction and Optimization of Tissue Culture System of Beach Suitable Honeysuckle

LI Shihui， ZHAO Gengmao et al （Jiangsu Key Laboratory of Marine Biology， School of Resource and Environmental Science， Nanjing Agricultural University， Nanjing， Jiangsu 210095）

Abstract [Objective] To construct and optimize tissue culture system of beach suitable honeysuckle. [Method] The mature stem foliar bud and blade were used as the explants using the mixed level orthogonal experiment design， and the combining medium schemes for inducing callus， differentiation and rooting， etc. were designed with different concentration of NAA IBA 6BA KT based on the MS culture medium， and the system of tissue culture and rapid propagation of honeysuckle was studied. [Result] The results showed that the callus development was effectively influenced by explants types， and hormone concentrations of media. The callus

induction and plant regeneration of foliar bud were significantly higher than the mature stem and blades， and it also can induce callus with compact constitution. The result also showed that the culture medium with different Plant Growth Regulators combination had great effect on the inducing rate， the best medium for callus induction was MS+6BA 0.05 mg/L+NAA 1.0 mg/L. MS with low concentration of auxin and cytokinin is adapt to inducing the differentiation of tufted bud by the callus of Honeysuckle， which is MS+NAA 0.03 mg/L+IBA 1.00 mg/L. The MS， MS+NAA 0.03 mg/L+IBA 1.00 mg/L， which induce the differentiation of roots can significantly improve the inducing rate of roots， make the tufted roots more compact and improve the propagative rate. [Conclusion] A technical system of tissue culture and rapid propagation of honeysuckle involves the optimum medium of every experiment step and the operating rules（the choice of explantsthe induction of callusthe differentiation of tufted bud rooting） is provided in this study.

Key words FLOS LONICERAE JAPONICAE； Tissue culture； Callus； Orthogonal test

金銀花（FLOS LONICERAE JAPONICAE）為忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾或帶初開的花，含有揮發(fā)油、黃酮類、三萜皂苷、有機(jī)酸及無機(jī)元素等，具有抑菌、抗病毒、解熱、抗炎、保肝和抗艾滋病等作用[1]。近年來，在中國逐漸被用作園林綠化觀賞、地被建設(shè)的優(yōu)良材料，還是極具開發(fā)潛力的藥用、經(jīng)濟(jì)植物資源，同時(shí)優(yōu)異耐鹽、抗旱基因也有待開發(fā)。課題組在耐鹽金銀花前期研究基礎(chǔ)上，著重介紹金銀花外植體的選擇、愈傷組織培養(yǎng)的方法，并改良了金銀花愈傷組織誘導(dǎo)叢芽、叢根的培養(yǎng)方法，以建立完善的金銀花組培快繁體系[10]。筆者對(duì)金銀花組織培養(yǎng)快繁的技術(shù)進(jìn)行研究，以期為耐鹽金銀花種苗產(chǎn)業(yè)化和規(guī)?；癁┩糠N植提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象。試驗(yàn)材料為當(dāng)年生金銀花莖段、葉芽和葉片，時(shí)間為春季[4]。材料選自安徽亳州。

1.1.2 主要試劑。所用試劑均為國產(chǎn)分析純，市售。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒處理。取金銀花莖段、葉芽和葉片，葉片切成0.5 cm×0.5 cm大小[3]，葉芽部位保留1.0 cm，莖段剪取1.5～2.0 cm[2]，振蕩洗滌后，用去離子水中浸泡15～20 min，放入超凈工作臺(tái)里，紫外燈照射5 min，無菌水震蕩洗滌1次。再用濃度75%乙醇和濃度4%次氯酸鈉消毒[8]，消毒時(shí)間如表1；無菌水沖洗6次，用無菌濾紙吸干外植體表面的水分。

1.2.2 誘導(dǎo)愈傷組織。以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的生長調(diào)節(jié)劑，共設(shè)計(jì)25種愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基M1M25（表2）。所有培養(yǎng)基內(nèi)均添加1.5 g蔗糖，0.35 g瓊脂，調(diào)至pH 5.8[4]。分裝于植物分化培養(yǎng)罐中，每罐50 ml，封口后在116 ℃條件下滅菌30 min，待培養(yǎng)基冷凝后，紫外線表面滅菌30 min，接種。在每種濃度處理中，每種材料接種3個(gè)罐子，每個(gè)罐子每種材料接種4個(gè)，重復(fù)3次。處理完后，組培苗均放在光照強(qiáng)度2 000 lx下28 ℃光照12 h/d，光照強(qiáng)度0 lx下25 ℃光照12 h/d的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[5]。

1.2.3 誘導(dǎo)叢芽分化。以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度生長調(diào)節(jié)劑[9]，共設(shè)計(jì)24種叢芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基Y1Y24（表3）。在無菌條件工作條件下，將長勢(shì)良好、結(jié)構(gòu)緊實(shí)、質(zhì)地青綠的愈傷組織塊取出，放在無菌濾紙上吸去多余水分，去除邊角褐化或玻璃化嚴(yán)重的區(qū)域，接種。在每種濃度處理中，每種材料接種3個(gè)罐子，每個(gè)罐子每種材料接種4個(gè)，重復(fù)3次。

1.2.4 誘導(dǎo)根分化。以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度生長調(diào)節(jié)劑，共設(shè)計(jì)24種愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基G1G24（表4）[6]。在無菌條件工作條件下，轉(zhuǎn)接已分化出叢芽的愈傷組織塊。在每種濃度處理中，每種材料接種3個(gè)罐子，每個(gè)罐子每種材料接種4個(gè)，重復(fù)3次。

1.2.5 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理。將試驗(yàn)中統(tǒng)計(jì)出來的數(shù)據(jù)按以下方法進(jìn)行處理[7]：愈傷組織誘導(dǎo)率（%）=（產(chǎn)生愈傷組織總數(shù)/接種的外植體總數(shù)）×100；不定芽誘導(dǎo)率（%）=（產(chǎn)生不定芽的愈傷組織/接種的愈傷組織總數(shù)）×100；生根率（%）=（生根的不定芽數(shù)/接種的不定芽數(shù)）×100；運(yùn)用數(shù)理統(tǒng)分析軟件IBM SPSS Statistics 20進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同類型的外植體對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織的效果的影響 圖1表明，葉芽在接種后第7天，所有葉芽切口均有膨大現(xiàn)象，并出現(xiàn)顆粒狀愈傷組織。而葉片切口處有膨大現(xiàn)象最早是第6天，9 d后所有葉片切口具有膨大現(xiàn)象，15 d后有顆粒狀的愈傷組織出現(xiàn)。葉芽比葉片出現(xiàn)愈傷組織的時(shí)間早2～7 d，并且，葉芽產(chǎn)生的愈傷組織其生長勢(shì)明顯優(yōu)于葉片。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，用莖段作外植體，誘導(dǎo)速度明顯低于葉芽和葉片。

圖1 外植株對(duì)愈傷組織的影響

2.2 培養(yǎng)基內(nèi)激素對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織的影響 由表5可知，6BA濃度為0時(shí)，NAA是在0.80～1.0 mg/L濃度范圍內(nèi)誘導(dǎo)效果較好，其中以濃度1.00 mg/L NAA的效果最佳，30 d內(nèi)的誘導(dǎo)率高達(dá)88.45%。隨濃度升高誘導(dǎo)率下降，與NAA濃度為1.00 mg/L產(chǎn)生了顯著差異（P<0.05）；濃度低于0.50 mg/L，誘導(dǎo)效果欠佳，與NAA濃度為1.00 mg/L產(chǎn)生極顯著差異（P<0.01）。NAA濃度為0時(shí)，6BA的作用效果隨濃度梯度的增大而減少，為濃度0.05 mg/L 6BA與2.00 mg/L的誘導(dǎo)率產(chǎn)生了極顯著的差異（P<0.01）。

2.4 培養(yǎng)基內(nèi)激素對(duì)誘導(dǎo)根分化的影響 將帶有不定叢芽的愈傷組織塊轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)根分化的培養(yǎng)基20 d后，帶有不定叢芽的愈傷組織均有長出不定根（表8）。

在培養(yǎng)基MS+ 0.03 mg/L NAA+1.00 mg/L IBA上，20 d內(nèi)根的分化最多、最快，分化率高達(dá)93.30%（圖5）。NAA濃度相同時(shí)，隨著IBA濃度的變化，根分化率產(chǎn)生了顯著差異，隨著NAA濃度梯度遞增，分化叢根的愈傷組織塊數(shù)量總體減少，根分化率降低。

3 結(jié)論與討論

葉芽相對(duì)于葉片和莖段外植體誘導(dǎo)愈傷組織的速度快，成活率高。誘導(dǎo)出來的愈傷組織結(jié)構(gòu)緊實(shí)、質(zhì)地青翠。生長調(diào)節(jié)劑6BA與NAA結(jié)合使用的誘導(dǎo)率會(huì)高于單個(gè)生長調(diào)節(jié)劑，從而篩選出金銀花誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為MS+0.05 mg/L 6BA+1.0 mg/L NAA。

金銀花誘導(dǎo)不定叢芽的最佳培養(yǎng)基為MS+0.1 mg/L 6BA+0.05 mg/L NAA。低濃度的6BA不會(huì)引起細(xì)胞的過度分裂，造成幼苗葉子枯黃的現(xiàn)象。激動(dòng)素KT會(huì)加速細(xì)胞分裂，形成稀疏泛黃的苗株，不宜施用于幼芽的愈傷組織塊。

金銀花誘導(dǎo)不定叢根的最佳培養(yǎng)基為MS+0.03 mg/L NAA+1.00 mg/L IBA，低濃度的NAA配合生長素IBA，更利于側(cè)根的形成。

參考文獻(xiàn)

[1]

茅青，曹東，賈憲生.灰氈毛忍冬化學(xué)成分的研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，1993，28（4）：273-278.

[2] 王曉明，李永欣，聶啟英.金銀花組織培養(yǎng)的研究進(jìn)展[J].湖南林業(yè)科技，2006（4）：1-3.

[3] 趙賢慧，劉慶華，王奎玲，等.誘導(dǎo)紅金銀花愈傷組織的影響因素研究[J].山東林業(yè)科技，2007（1）：9-11.

[4] 劉連芬，錢關(guān)澤.金銀花愈傷組織的誘導(dǎo)和分化[J]. 聊城大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007（4）： 48-50，107.

[5] 易靄琴，王曉明，宋慶安，等.灰氈毛忍冬（金銀花）組培苗移栽技術(shù)研究[J]. 湖南林業(yè)科技，2005（3）：34-35.

[6] 王曉明，李永欣，易靄琴，等.灰氈毛忍冬新品種組培高效增殖體系的建立[J].林業(yè)科技開發(fā)，2006，20（6）：62-64.

[7] 韓蓉，于曉英，鄭夢(mèng)龍，等.湘蕾金銀花葉柄、莖段的離體培養(yǎng)與植株再生[J]. 中國園藝文摘，2012（12）：1-3，18.

[8] 趙賢慧，劉慶華，張德鋒.紅金銀花組織培養(yǎng)外植體滅菌的研究[J]. 江蘇林業(yè)科技，2007（1）：23-25.

[9] 曹芳莉. 灰氈毛忍冬（金銀花）愈傷組織及多倍體的誘導(dǎo)[D].長沙：中南林業(yè)科技大學(xué)，2008.

[10] 梁小敏，羅贛豐，吳淼生.金銀花快繁技術(shù)比較研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（32）：13964-13965.

[11] 王慧俐，江小紅.灰氈毛忍冬（ 金銀花） 的組織培養(yǎng)研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（30）：11952-11953，11964.