杜曉春

【摘要】 本文簡(jiǎn)要介紹高效液相色譜技術(shù)的歷史發(fā)展，對(duì)幾種常見的高效液相色譜進(jìn)行了介紹，評(píng)述了高效液相色譜法（HPLC）在藥物分析的應(yīng)用。由于HPLC具有專屬性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)，因此在藥物成分的分離與測(cè)定方面充分發(fā)揮了其優(yōu)勢(shì)。

【關(guān)鍵詞】 高效液相色譜；藥物分析中；應(yīng)用

文章編號(hào)：1004-7484（2014）-06-3049-02

1 高效液相色譜（HPLC）概論

1.1 高效液相色譜的歷史發(fā)展 高效液相色譜的發(fā)展始于20世紀(jì)60年代，由于其具有分離和分析的雙重功能，且有很高的選擇性和較高的靈敏度，因而可同時(shí)分析結(jié)構(gòu)相似的藥物和代謝物等。色譜法中以高效液相色譜法最為常用，因其克服了經(jīng)典液相色譜法柱效低，分離時(shí)間很長(zhǎng)的缺點(diǎn)，成為一種高效、快速的分離技術(shù)。特別是反相高效液相色譜法（RP-HPLC）更具有試劑價(jià)廉、方法簡(jiǎn)單和適應(yīng)范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成為體內(nèi)藥物分析方法中最重要的方法，并常作為體內(nèi)藥物分析中評(píng)價(jià)其它方法的參比方法。

1.2 高效液相色譜的特點(diǎn) ①高壓；②高速；③高效；④高靈敏度；⑤適應(yīng)范圍寬。

1.3 高效液相色譜分類 高效液相色譜法按分離機(jī)理的不同可分為以下幾類：①吸附色譜法，以吸附劑為固定相的色譜方法稱為吸附色譜法；②液-液分配色譜法，液-液分配色譜的固定相和流動(dòng)相是互不相溶的兩種溶劑，分離時(shí)，組分溶入兩相，不同的組分因分配系數(shù)（K）的不同而被分離；③離子交換色譜法離子對(duì)交換色譜法是以離子交換劑為固定相的色譜方法，組分因和離子交換劑親和力的不同而被分離；④空間排斥色譜法，空間排斥色譜也稱為凝膠色譜。其固定相是具有一定孔徑范圍的多孔性物質(zhì)，即凝膠；⑤親和色譜法，親和色譜法是利用或模擬生物分子之間的專一性作用，從生物樣品中分離和分析一些特殊物質(zhì)的色譜方法；⑥手性色譜法，不少有機(jī)藥物的結(jié)構(gòu)中有不對(duì)稱碳原子，又稱手性碳原子，有手性碳原子的藥物具有旋光性。立體構(gòu)型不同的一對(duì)對(duì)映體，其藥效、毒副作用往往不相同。

2 在藥物分析中的應(yīng)用

在藥物分析中，高效液相色譜已成為各類藥物及其制劑進(jìn)行鑒別、檢查、雜質(zhì)分離及含量測(cè)定的重要手段。

2.1 在鑒別中的應(yīng)用 在HPLC法中，由于保留時(shí)間與組分的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)有關(guān)，不同的藥物由于結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的差異在譜圖上出峰順序不同，因而根據(jù)這定性的參數(shù)可用于藥物的鑒別。如中國(guó)藥典收載的藥物頭孢羥氨芐的鑒別項(xiàng)下規(guī)定：在含量測(cè)定項(xiàng)下記錄的色譜圖中，供試品主峰的保留時(shí)間應(yīng)與對(duì)照品主峰的保留時(shí)間一致。

2.2 在雜質(zhì)檢查中的應(yīng)用 在HPLC分離檢測(cè)中的保留時(shí)間不同，用HPLC對(duì)藥物鑒別和雜質(zhì)檢查，具有較強(qiáng)的專屬性，HPLC分離效能高，靈敏，在藥物的雜質(zhì)檢查中應(yīng)用廣泛。藥物中有關(guān)雜質(zhì)主要是藥物中存在的合成原料、中間體、副產(chǎn)物、降解產(chǎn)物等物質(zhì)，這些物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與藥物相似，含量很低，只有采用色譜的方法才能將其分離并檢測(cè)。

2.3 在含量測(cè)定中的應(yīng)用 色譜圖面積與濃度呈線性關(guān)系是其可以定量測(cè)定的依據(jù)。高效液相色譜法專屬性強(qiáng)、靈敏度高，在藥物含量測(cè)定中的應(yīng)用十分廣泛。如中國(guó)藥典中合成藥及其制劑，用其測(cè)定含量可以消除藥物中的雜質(zhì)，制劑中的附加劑及共存的藥物對(duì)測(cè)定的干擾。中藥材及其制劑組成復(fù)雜，其中不少有效成分的含量測(cè)定也越來越多地采用了高效液相色譜法。

2.3.1 常用藥物分析中的應(yīng)用 常用藥物系指解熱鎮(zhèn)痛藥、鎮(zhèn)靜藥、心血管藥等。HPLC能很好的分離這些藥物中的各種有效成分。例如，中國(guó)藥典記錄的阿斯匹林、非那西丁、咖啡因的含量測(cè)定。

2.3.2 甾體藥物分析中的應(yīng)用 甾體藥物主要是指甾醇的衍生物，其可分為腎上腺皮激素、雄性激素、雌性激素和孕激素。各類型的甾體藥物都可以用HPLC成功的分離。例如炔諾孕酮用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定含量。

2.3.3 抗菌素類藥物分析中的應(yīng)用 抗菌素種類繁多，臨床應(yīng)用廣泛，依據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同，可分為B_內(nèi)酰胺類抗菌素、氨基糖苷類抗菌素、四環(huán)素類抗菌素、氟喹諾酮類抗菌素等。HPLC分析技術(shù)近年來在抗生素的質(zhì)量控制中已廣泛應(yīng)用。對(duì)結(jié)構(gòu)、組分等較清楚的藥物，HPLC分析將逐步取代傳統(tǒng)的生物測(cè)定。目前，各國(guó)藥典中應(yīng)用HPLC技術(shù)對(duì)抗生素進(jìn)行質(zhì)量控制的項(xiàng)目包括鑒別、組分分析、含量測(cè)定和相關(guān)物質(zhì)測(cè)定等。如青霉素有效成分的分離可采用反相鍵合色譜法，硫酸慶大霉素C組分的含量測(cè)定。

2.3.4 手性藥物分析中的應(yīng)用 兩種化學(xué)組成、分子式完全相同的化合物，但因組成化合物的原子在空間取向不同，而成為鏡像的化合物，或稱為手性化合物。由于對(duì)映體的物理、化學(xué)性質(zhì)相同，實(shí)現(xiàn)它們的分離就比較困難，如大多數(shù)氨基酸都有右旋體和左旋體，但往往只能獲得右旋體和左旋體的混合物。對(duì)于手性藥物往往呈現(xiàn)一種對(duì)映體具有強(qiáng)的生物活性和藥效，而另一種卻無效。手性藥物HPLC法現(xiàn)已成為手性藥物質(zhì)量控制和新藥研發(fā)中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)。如對(duì)酮康唑外消旋體采用C18鍵合固定相，以磺丁基-B-環(huán)糊精為手性流動(dòng)相添加劑進(jìn)行拆分而使酮康唑的右旋體和左旋體得以分離。

2.4 生物藥物分析中的應(yīng)用 生物藥物是從動(dòng)、植物、微生物中提取的、生物-化學(xué)半合成的或用現(xiàn)代生物技術(shù)制得的生命基本物質(zhì)及其衍生物、降解物。包括生化藥物和生物制品等。例如中國(guó)藥典對(duì)重組人生長(zhǎng)激素、重組人胰島素、重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的鑒別。

2.5 在血藥濃度檢測(cè)中的應(yīng)用 藥物在體內(nèi)經(jīng)過吸收、分布，可形成一定的血藥濃度，利用高效液相色譜法可監(jiān)測(cè)藥物的血藥濃度，保證用藥安全。如對(duì)乙酰氨基酚急性中毒的血藥濃度的檢測(cè)：對(duì)乙酰氨基酚是臨床上使用極其廣泛的解熱鎮(zhèn)痛藥，由于患者狀態(tài)的多樣性以及對(duì)酰氨基酚中毒的早期癥狀與胃潰瘍癥狀極其相似且肝功正常，故常常發(fā)生漏診，等到發(fā)生肝損傷已經(jīng)錯(cuò)過了治療最佳時(shí)機(jī)。因此，國(guó)外已將對(duì)乙酰氨其酚血濃度作為急診中毒病人常規(guī)檢測(cè)。色譜條件：采用Nova-PakC18柱（4μm，150mm×3.9mm），柱溫25℃；流動(dòng)相為甲醇-水（30：30），流速為0.8ml/min；二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm。血漿樣品制備；取靜脈血3ml-4ml，置含肝素抗凝劑的離心管中，離心分離5min（3000r/min），上清液為待測(cè)血漿。取上述血漿1ml，加飽和硫酸鋅溶液1ml，沉淀蛋白后，加入乙醚5ml，渦漩混合1min，離心20min（3000r/min）。精密吸取乙醚液3.0ml于50℃氮?dú)饬鞔蹈?，冷至室溫，以蒸餾水500μl溶解殘?jiān)?，?0μl進(jìn)樣。對(duì)照品溶液制備；配制對(duì)乙酰氨基酚甲醇溶液（10mg/ml），并用甲醇逐級(jí)稀釋成濃度為0.01mg/ml-5mg/ml的對(duì)照品溶液，4℃冰箱存放備用。血漿中對(duì)乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線制備；取肝素抗凝的血漿1ml，分別加入不同濃度的對(duì)乙酰氨基酚工作液100μl，使血漿中藥物濃度為0.9μg/ml-454.5μg/ml，再按“血漿樣品制備”項(xiàng)下方法操作，記錄色譜圖，以溶液C對(duì)峰面積A作線性回歸，得回歸方程：A=1.64×104+1.68×107C，R=0.9995，線性范圍為0.9μg/ml-454.5μg/ml，最低檢測(cè)濃度為0.9μg/ml（以信噪比≥3計(jì)）。用HPLC測(cè)定可疑中毒病人血中對(duì)乙酰氨基酚濃度具有準(zhǔn)確、快速的優(yōu)點(diǎn)，可有效地幫助臨床醫(yī)生確診，快速有效地救治患者，對(duì)提高醫(yī)療質(zhì)量有重要意義。

2.6 天然藥物分析中的應(yīng)用 由于天然藥物的化學(xué)成分復(fù)雜，對(duì)于控制藥品質(zhì)量，建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)來說比較困難，HPLC可通過對(duì)天然藥物的有效成分進(jìn)行分離鑒定，再測(cè)定有效成分的含量；通過指紋圖譜建立識(shí)別模式，可以判定藥材的質(zhì)量高低。

3 高效色譜法在藥物分析的研究動(dòng)向及應(yīng)用進(jìn)展

3.1 檢測(cè)手段的進(jìn)步 近年來，高效液相色譜教重要的發(fā)展方面是檢測(cè)器的發(fā)展，如二極管陣列檢測(cè)器和高效液相蒸發(fā)激光散射檢測(cè)器，可以用高效液相二極管陣列檢測(cè)器分離檢測(cè)銀杏等葉中黃酮成分，用高效液相蒸發(fā)激光散射檢測(cè)器測(cè)定銀杏葉提取物中內(nèi)酯的含量等。儀器的進(jìn)一步發(fā)展，HPLC在藥物分析中會(huì)成為更加有效的高靈敏度的方法和可操作性。

3.2 二（多）維色譜 為了從復(fù)雜樣品中分離或定量某一特定成分，可采用兩種或兩種以上的不同的色譜方法，即采用二維或多維色譜，多維色譜能夠靈活應(yīng)用傳統(tǒng)HPLC，在復(fù)雜生物樣品的分析中表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢(shì)，有著廣泛的應(yīng)用前景。

3.3 色譜技術(shù)的聯(lián)用 目前，對(duì)某一復(fù)雜樣品的分析很難用單一分析分離方法解決，使用HPLC聯(lián)用技術(shù)是發(fā)展趨勢(shì)之一。如液相色譜—質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用可用于藥物代謝研究、天然產(chǎn)物快速分析以及生物大分子分析

3.4 微液相色譜的研究 由于微液相色譜分析所需的樣品量及流動(dòng)相的消耗大大下降，檢測(cè)靈敏度又大大提高，相信此法在藥物分析中也能發(fā)揮它的優(yōu)點(diǎn)。

4 結(jié)論和展望

綜上所述，HPLC是現(xiàn)代分離測(cè)定的重要手段。由于它具有專屬性強(qiáng)、簡(jiǎn)便快速、靈敏度高等特點(diǎn)，既可用于分離也可用于定量分析，適用于各種各樣的有機(jī)化合物，因此目前在藥物成分的分離與測(cè)定方面得到了廣泛的應(yīng)用。相信隨著檢測(cè)手段的進(jìn)步、各種聯(lián)用技術(shù)的出現(xiàn)以及其他一些相關(guān)問題的解決，HPLC在醫(yī)藥研究中將會(huì)發(fā)揮越來越重要的作用。

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