宮琨

【摘要】 目的 探討活化小膠質(zhì)細(xì)胞在急性腦梗死中的作用及其機(jī)制，為診療提供靶點(diǎn)與途徑。方法 配置小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記液并建立急性腦梗死模型小鼠，分別于12h、24h、72h輸注，測(cè)定相關(guān)指標(biāo)對(duì)比。結(jié)果 于手術(shù)后12h、24h、72h移植，小膠質(zhì)細(xì)胞于小鼠體內(nèi)分布差異顯著，小膠質(zhì)細(xì)胞隨著時(shí)間推移向梗死病灶周圍聚集；12h后移植小鼠使用前肢的次數(shù)較24h、72h后移植顯著增加；12h后移植小鼠腦梗死面積小于24h、72h移植者，差異顯著（P<0.05）。結(jié)論 活化小膠質(zhì)細(xì)胞在急性腦梗死中發(fā)揮重要作用，通過抑制神經(jīng)細(xì)胞壞死促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活，進(jìn)而影響患者神經(jīng)功能與梗死體積，對(duì)預(yù)防、診療急性腦梗死具有一定的價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】 活化小膠質(zhì)細(xì)胞；急性腦梗死；機(jī)制研究

文章編號(hào)：1004-7484（2014）-06-3123-01

腦梗死又名缺血性腦卒中，是局部腦卒中因血液循壞障礙，致缺血、缺氧而發(fā)生軟化壞死的一種腦部病變，其中急性腦梗死具有發(fā)病率高、死亡率高、致殘率高的特點(diǎn)[1]。腦梗死病因復(fù)雜，近年來隨著危險(xiǎn)因素的增多，人口進(jìn)入老齡化，我國(guó)急性腦梗死發(fā)病率逐年增高，給患者及其家屬帶來巨大的傷害，深入研究急性腦梗死的發(fā)病機(jī)制、相關(guān)因素對(duì)于該病的預(yù)防、診療具有重要意義。本次研究運(yùn)用活化小膠質(zhì)細(xì)胞在急性腦梗死小鼠中的作用及其機(jī)制進(jìn)行闡述。

1 資料及方法

1.1 一般資料 取清潔級(jí)成年雄性昆明小鼠，體重25-35g，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，飼養(yǎng)室溫度20-25℃恒溫，安靜環(huán)境，實(shí)驗(yàn)前5日取至觀察室[2]。

1.2 方法 選用倒置相差熒光顯微鏡、低速離心機(jī)、手術(shù)顯微鏡、磁力加熱攪拌器、全自動(dòng)生化分析儀等儀器設(shè)備，選用細(xì)胞示蹤檢測(cè)試劑盒、TTC等試劑，配制完好的原代培養(yǎng)第三代小膠質(zhì)細(xì)胞。

小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記：于15ml離心管離心1ml CFDA-SE細(xì)胞標(biāo)記液懸浮1.0×107細(xì)胞，取2μl配置好的小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記儲(chǔ)存液（1000×）與前者混合，搖勻配置為CFDA-SE存儲(chǔ)液（2×），將存有細(xì)胞CFDA-SE標(biāo)記液與儲(chǔ)存液（2×）1ml混合，以37℃恒溫孵育10min，向離心管內(nèi)傾入15%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基混勻后以1200r/min離心持續(xù)5min取上清液再行洗滌，加入8ml完全培養(yǎng)基，孵育5min再次離心取上清液，再次加入10ml完全培養(yǎng)基，置于37℃恒溫5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，標(biāo)記完成[3]。取第3代小膠質(zhì)細(xì)胞CFDA為標(biāo)記組，余下MG為對(duì)照組用MTT法檢測(cè)CFDA SE標(biāo)記，確認(rèn)標(biāo)記對(duì)小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞影響不顯著再行實(shí)驗(yàn)。建立局灶性小鼠腦梗死模型：選用0.16mm單絲尼龍線處理后制備完成，采用右側(cè)大腦動(dòng)脈栓塞，于小鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，用牙次刺之驗(yàn)證麻醉完全，常規(guī)消毒后于手術(shù)顯微鏡下手術(shù)；剪開小鼠皮下組織，取頸動(dòng)脈分離總動(dòng)脈與迷走神經(jīng)并結(jié)扎、夾閉，將標(biāo)記栓線插入頸總動(dòng)脈開口并推送至小鼠大腦動(dòng)脈起始部，將切口與栓線一同結(jié)扎后置于養(yǎng)殖箱中，選取假手術(shù)組步驟與手術(shù)組同但未插入栓塞[4]。

隨機(jī)抽取實(shí)驗(yàn)鼠采用MRI檢測(cè)模型穩(wěn)定性，穩(wěn)定性滿意后繼續(xù)實(shí)驗(yàn)；再次麻醉小鼠后固定，使用超導(dǎo)高場(chǎng)磁共振掃描儀，對(duì)冠狀動(dòng)脈進(jìn)行檢測(cè)。將培養(yǎng)好的小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行制備后以手術(shù)組小鼠作為移植對(duì)象，剪去后者頸前毛發(fā)后經(jīng)鎖骨下靜脈向心臟方向注射標(biāo)記好的小膠質(zhì)細(xì)胞懸液50μl，以慶大霉素縫合；于移植后12、24、72h脫頸處死小鼠取其腦進(jìn)行冰凍切片處理，以包埋劑冰凍，以切片機(jī)切片，厚度5μm，于熒光顯微鏡下觀察小膠質(zhì)細(xì)胞情況。

2 結(jié) 果

于手術(shù)后12h、24h、72h移植標(biāo)記液小鼠大腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞分布差異顯著，小膠質(zhì)細(xì)胞隨著時(shí)間推移向梗死病灶周圍聚集；12h后移植標(biāo)記液小鼠使用前肢的次數(shù)較24h、72h顯著增加；12h后移植標(biāo)記液小鼠腦梗死面積小于24h、72h移植者。

3 討 論

小膠質(zhì)細(xì)胞（microglia，MG）廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，數(shù)量極多，約占神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞總數(shù)5%-20%，其形態(tài)、免疫表型和生物學(xué)功能與單核/巨噬細(xì)胞性相似，學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為其為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要免疫效應(yīng)細(xì)胞[4]。小膠質(zhì)細(xì)胞在生理?xiàng)l件正常、異常情況下均可發(fā)揮重要作用，具有監(jiān)視腦部環(huán)境改變與預(yù)防外在感染及有毒物質(zhì)的作用。本次研究中，經(jīng)標(biāo)記培養(yǎng)制備的小膠質(zhì)細(xì)胞與小鼠體內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞并無顯著性差異，通過輸注入急性腦梗死模型小鼠中，隨著時(shí)間的推移漸漸向病灶區(qū)域轉(zhuǎn)移，及早輸注小鼠其病灶面積相對(duì)較小、前肢活動(dòng)次數(shù)較多，差異顯著（P<0.05），說明小膠質(zhì)細(xì)胞應(yīng)用于腦梗死中具有抑制病灶發(fā)展、保護(hù)神經(jīng)的作用，具有一定的臨床價(jià)值，相信隨著相關(guān)人類實(shí)驗(yàn)取得更多有價(jià)值的結(jié)果，其臨床價(jià)值必將愈加凸顯。

參考文獻(xiàn)

[1] 王淑英，鄔劍，李堯，等.EGB對(duì)大鼠局灶性腦缺血—再灌注中小膠質(zhì)細(xì)胞的影響[J].黑龍家醫(yī)藥科學(xué)，2013，36（05）：46-47.

[2] 劉學(xué)華.動(dòng)物腦炎和腦軟化的病理特點(diǎn)[J].養(yǎng)殖技術(shù)顧問，2013，13（09）：8-9.

[3] 仁富亮，宋少偉，李恩東.神經(jīng)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的相互作用于神經(jīng)變性性疾病的關(guān)系[J].中國(guó)衛(wèi)生產(chǎn)業(yè)，2013，35（25）：156-157.

[4] 潘新發(fā)，萬曙.小膠質(zhì)細(xì)胞在腦出血后繼發(fā)性腦損傷中的作用[J].中國(guó)神經(jīng)精神疾病雜志，2013，39（17）：437-438.