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人外周血內(nèi)皮組細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定

2014-05-30 10:48付強(qiáng)鄭昭芬彭建強(qiáng)何晉王照飛

付強(qiáng) 鄭昭芬 彭建強(qiáng) 何晉 王照飛

【摘要】 從外周血中分離單個(gè)核細(xì)胞(MNCs),種植在纖維連接蛋白(Fn)包被的六孔板,以EGM-2培養(yǎng)基定向誘導(dǎo)培養(yǎng)。培養(yǎng)第4天,全量換液后可見梭形或多角形貼壁細(xì)胞,鏡下可見多個(gè)呈“血島”樣生長(zhǎng)的細(xì)胞集落,集落中間為聚集成簇的圓形細(xì)胞,周邊環(huán)繞放射狀梭形細(xì)胞。培養(yǎng)初始2周,梭形細(xì)胞首尾相連呈條索樣生長(zhǎng)或兩排細(xì)胞平行排列呈管樣生長(zhǎng),并可見條索樣或管樣排列的細(xì)胞相互交錯(cuò)成網(wǎng)。培養(yǎng)至第3周,細(xì)胞呈現(xiàn)為鋪路石樣外觀;經(jīng)傳代后具有次級(jí)集落形成能力。流式細(xì)胞術(shù)顯示內(nèi)皮組細(xì)胞(EPCs)表面標(biāo)志物CD34,KDR呈陽性,而單核、巨噬細(xì)胞系表面標(biāo)志物CD14無表達(dá)。激光共聚焦顯微鏡下,EPCs具有攝取Dil-acLDL和結(jié)合FITC-UEA-1的能力。

【關(guān)鍵詞】 單個(gè)核細(xì)胞;內(nèi)皮祖細(xì)胞;細(xì)胞形態(tài)學(xué);細(xì)胞表型

doi:10.3969/j.issn.1004-7484(x).2014.05.013 文章編號(hào):1004-7484(2014)-05-2417-02

1 材料與方法

1.1 材料 淋巴細(xì)胞分離液購自天津?yàn)螅姿峋彌_鹽溶液(PBS)、胎牛血清(FBS)、青鏈霉素購自Hyclone,EGM-2購自Lonza,胰蛋白酶購自Amresco,人纖維連接蛋白(HFN)購自merck,DiI-acLDL購自Molecular probes,F(xiàn)ITC-UEA-I、Galetin購自Sigma,PerCP/Cy5.5-KDR、PerCP/Cy5.5-IgG購自BioLegend,PE-CD34、PE-IgG、FITC-CD34、FITC-IgG購自Beckerman。外周學(xué)取自本課題組志愿者。

1.2 方法

1.2.1 密度梯度離心法分離人外周血MNCs及其誘導(dǎo)培養(yǎng)

1.2.1.1 采集人外周血25ml至含枸櫞酸鈉的50ml離心管 然后將抗凝血用PBS等倍稀釋;將稀釋后的抗凝血與人淋巴細(xì)胞分離液按1:1的比例沿離心管壁緩慢置于淋巴細(xì)胞分離液上,4℃、400g離心30min;離心后分為4層:上層為血漿、血小板和PBS,中層為淋巴細(xì)胞分離液,底層為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞,中層與上層交界呈混濁的白膜層為MNCs層;用移液槍吸取MNCs層收集于新的50ml離心管中,用適量PBS洗滌兩遍;洗滌條件為:4℃、250g離心10min。

1.2.1.2 接種前預(yù)先將6孔板用50ug/mlFn包被24小時(shí)(5μg/cm2),接種時(shí)吸棄Fn,用PBS洗滌2次;用EGM-2誘導(dǎo)培養(yǎng)液(含10%FBS和100U/ml青鏈霉素)重懸MNCs;用EGM-2誘導(dǎo)培養(yǎng)液調(diào)整其濃度至5×106個(gè)/mL,接種至6孔板中,每孔加2mL,置于37℃,5%CO2,濕度大于95%下培養(yǎng);4天后首次更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),以后根據(jù)營(yíng)養(yǎng)狀況每周換液2-3次,相差顯微鏡下觀察內(nèi)皮祖細(xì)胞的形態(tài)特征。

1.2.1.3 待細(xì)胞融合約80%時(shí) 棄盡舊培養(yǎng)液,用2mlPBS洗滌2次,用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA200μL消化約1min,倒置顯微鏡下觀察,若細(xì)胞胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增寬、細(xì)胞變圓,立即用EGM-2培養(yǎng)液2mL終止消化,輕柔吹打混勻細(xì)胞;吸取細(xì)胞懸液置入15mL離心管中,用PBS稀釋至15mL,4℃下100g離心5min,洗滌后加入EGM-2培養(yǎng)液重懸細(xì)胞;細(xì)胞計(jì)數(shù)后以1×104/cm2的接種密度進(jìn)行傳代,根據(jù)營(yíng)養(yǎng)狀況每周換液2-3次。

1.2.2 人外周血EPCs的鑒定

1.2.2.1 EPCs表型流式細(xì)胞術(shù)鑒定 第二代細(xì)胞培養(yǎng)至約80%融合時(shí)消化至加入1mlPBS的EP管中,250g離心5min洗滌細(xì)胞;用PBS重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×107/ml,取100ul細(xì)胞混懸液置于編號(hào)(A,a-C,c)的EP管中;A-C管中分別加入下述直標(biāo)抗體10ul:鼠抗人PE-CD34、鼠抗人PerCP/Cy5.5-KDR、鼠抗人FITC-CD14,同型對(duì)照a-c管中加入等量各自熒光標(biāo)記的鼠IgG,室溫避光孵育1h;孵育完畢后各管加入PBS500u1,250g,離心5min,用500u1PBS重懸、混勻后,AccuriC6流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.2.2 EPCs攝取Dil-acLDL和結(jié)合FITC-UEA-1的功能鑒定 細(xì)胞接種前將圓形蓋玻片浸于含200μlGaletin的24孔板中,孵育過夜;次日吸棄Galetin,消化第二代細(xì)胞,傳代接種至24孔板中蓋玻片上,根據(jù)營(yíng)養(yǎng)狀況及時(shí)更換培養(yǎng)基;待細(xì)胞融合約50%時(shí)吸棄培養(yǎng)基,PBS漂洗3次,避光加入含Di1-ac-LDL(10ug/mL)的培養(yǎng)液200ul,置于37℃,5%C02,95%濕度下孵育4小時(shí);孵育完畢吸棄培養(yǎng)液,PBS漂洗3次,加入4%多聚甲醛固定30min;吸棄4%多聚甲醛,PBS漂洗3次,避光加入FITC-UEA-1(10ug/mL)200ul,置于37℃,5%C02,95%濕度下1小時(shí)。滴少量Fluorescence Mounting Medium于載玻片上,用鑷子小心將蓋玻片夾出,PBS浸洗3次,吹干后覆蓋于載玻片上,激光共聚焦顯微鏡觀察,拍照。

2 結(jié)果

2.1 EPCs形態(tài)學(xué)特征 外周血MNCs誘導(dǎo)培養(yǎng)第4天,全量換液后可見梭形或多角形貼壁細(xì)胞(圖1A),鏡下可見多個(gè)呈“血島”樣生長(zhǎng)的細(xì)胞集落,集落中間為聚集成簇的圓形細(xì)胞,周邊環(huán)繞放射狀梭形細(xì)胞(圖1B)。誘導(dǎo)培養(yǎng)初始2周,梭形細(xì)胞形態(tài)逐漸變細(xì)長(zhǎng),數(shù)量逐漸減少,未表現(xiàn)出明顯的增殖能力,期間可見細(xì)胞首尾相連呈條索樣生長(zhǎng)或兩排細(xì)胞平行排列呈管樣生長(zhǎng),并可見條索樣或管樣排列的細(xì)胞相互交錯(cuò)成網(wǎng)(圖1C)。誘導(dǎo)培養(yǎng)至第3周,細(xì)胞呈現(xiàn)為鋪路石樣外觀;經(jīng)傳代后橢圓形細(xì)胞具有次級(jí)集落形成能力(圖1D);傳代后細(xì)胞增殖迅速,3-4天細(xì)胞即融合成片。

2.2 EPCs的鑒定

2.2.1 EPCs表型流式細(xì)胞術(shù)鑒定 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EPCs的表面標(biāo)志,結(jié)果顯示CD34,KDR呈陽性,而CD14無表達(dá)。

2.2.2 EPCs攝取Dil-acLDL和結(jié)合FITC-UEA-1的功能鑒定 激光共聚焦顯微鏡下,EPCs胞吞Dil-ac-LDL入胞漿,可見圍繞胞核呈紅色熒光的內(nèi)吞泡;胞膜結(jié)合FITC-UEA-1,呈現(xiàn)為綠色熒光,并胞吞入胞漿與攝取的Dil-ac-LDL共同呈現(xiàn)為黃色熒光。

3 討論

分析認(rèn)為這些單核巨噬系細(xì)胞促進(jìn)血管新生的機(jī)制在于其旁分泌功能,即通過分泌促血管生成的細(xì)胞因子刺激EPCs成血管。因此也被稱為循環(huán)促成血管細(xì)胞(circulating angiogenic cells,CACs)。由此可見,不論是貼壁還是非貼壁細(xì)胞,經(jīng)這些方法誘導(dǎo)培養(yǎng)后,都具有內(nèi)皮細(xì)胞的一些特征,并參與血管新生,但卻不直接形成新生血管。

我們將外周血MNCs誘導(dǎo)培養(yǎng)第4天后可見梭形或多角形貼壁細(xì)胞(圖1A),鏡下可見多個(gè)呈“血島”樣生長(zhǎng)的細(xì)胞集落,集落中間為聚集成簇的圓形細(xì)胞,周邊環(huán)繞放射狀梭形細(xì)胞(圖1B)。表現(xiàn)出早期EPCs的形態(tài)特征。本研究誘導(dǎo)培養(yǎng)第3周,成功獲得了鋪路石樣細(xì)胞;經(jīng)傳代后具有次級(jí)集落形成能力(圖1D);該細(xì)胞增殖迅速,3-4天細(xì)胞即融合成片,表現(xiàn)為晚期EPCs的形態(tài)特征。隨后我們采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了細(xì)胞的表面標(biāo)志,結(jié)果顯示內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34,KDR呈陽性,而單核、巨噬細(xì)胞系表面標(biāo)志物CD14無表達(dá)(圖2);與上文所述的晚期EPCs特征相符。最后,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步從功能學(xué)角度鑒定了誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞,說明該細(xì)胞具有內(nèi)皮功能。

參考文獻(xiàn)

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